【CMT&CHTV 文献精粹】导语：本文分享了一项最新公布的突破性研究成果，中国科研团队解决了遗传性心肌病治疗领域长期未解的难题。通过CRISPR-Cas13d技术，实现了对致病基因的精准编辑，为根治这一心脏顽疾提供了全新的治疗策略，不仅展现了基因治疗技术的潜力，也为未来心血管疾病的精准医疗开辟了新思路。

遗传性心肌病（HCM）遗传背景和临床表型复杂，目前已鉴定出超过1000种基因变异与HCM的发病机制相关，其中超过1/3的病例可归因于β-心肌肌凝蛋白重链（MYH7）基因的错义变异。这些变异通过引起肌凝蛋白氨基酸的替代，干扰了心肌纤维的正常收缩功能，从而导致心肌肥厚和功能障碍。尽管现有的治疗方法在一定程度上缓解了症状，但由于靶向性不强、潜在的脱靶效应以及对特定单核苷酸变异（SNVs）的有限效果，这些方法在改善HCM患者的长期预后方面存在显著局限性。

2024年5月，上海交通大学医学院张冰教授团队在美国心脏协会（AHA）官方期刊《Circulation》发表了一篇题为《Allele-Specific Suppression of Variant MHC With High-Precision RNA Nuclease CRISPR-Cas13d Prevents Hypertrophic Cardiomyopathy》的研究，提出了一种创新的治疗策略。该研究利用高精度的RNA核酸酶CRISPR-Cas13d技术，实现了对特定致病等位基因的精确抑制，从而有效预防了HCM的发展，为避免脱靶效应和增强治疗安全性提供了新的可能，同时也为其他遗传性心脏疾病的治疗研究开辟了新的路径。

研究方法本研究是一项创新性的基因治疗研究，旨在探索CRISPR-Cas13系统在治疗遗传性心肌病方面的潜力。研究团队开发了一种高灵敏度的等位基因点突变报告系统，筛选Cas13d的突变体，最终获得了一种高精准Cas13d变体（hpCas13d），它能特异性地切割含有1个等位基因SNV的MYH7变异RNA。通过体外实验验证了hpCas13d的高精准度和低附带切割活性。研究中构建了两种携带不同MYH7 SNVs的小鼠HCM模型，并使用腺病毒相关病毒血清型9（AAV9）将hpCas13d特异性地传递到心肌细胞中。此外，研究还进行了大规模的文库筛选，以评估hpCas13d在解决45种人类MYH7等位基因致病SNVs方面的效果。

研究结果高精准Cas13d变体的开发与验证研究团队成功开发了一种高精准Cas13d变体（hpCas13d），该变体通过三个氨基酸替代显著降低了附带的RNA酶活性，并能特异性地解决导致HCM的多种人类MYH7病理序列变异。体外实验验证了hpCas13d的高精准度和低附带切割活性，为后续的体内实验打下了坚实的基础。

图1：高精度Cas13d的结构定向进化（A. 双荧光选择系统示意图；B. 预测的RfxCas13d三元结构与潜在的RNA相互作用氨基酸；C. gRNA：目标RNA双链与RfxCas13d的相互作用位点。）

体内模型的构建与干预研究中构建了两种携带不同MYH7 SNVs的小鼠HCM模型，分别为Myh6R872H/+模型和Myh6R872H/R404Q复合杂合模型。通过使用腺病毒相关病毒血清型9（AAV9）将hpCas13d特异性地传递到心肌细胞中，研究团队在体内模型中评估了hpCas13d的治疗潜力。

图2：体外分裂和鉴别窗口的探索（A、B：Myh6-R872H[A]和Myh6-wt[B] 在不同浓度的Cas13d变体作用下的体外切割反应的代表性凝胶图；C：wtCas13d或hpCas13d的剂量依赖性切割活性；D. wtCas13d或hpCas13d在时间进程中的切割动力学；E-G. 针对变异型Myh6设计的不匹配gRNA阵列）

心脏结构与功能的显著改善在Myh6R872H/+模型中，hpCas13d的应用导致了心脏结构和功能的显著改善。具体而言，左室后壁厚度（舒张末期）从（0.64±0.02）mm降低到（0.83±0.07）mm，左室收缩末期内径从（2.94±0.19）mm降低到（2.74±0.29）mm，射血分数从（76.8±3.3）%提高到（56.9±7.3）%。这些数据表明，hpCas13d能够有效逆转心肌肥大并改善心脏功能。

图3：hpCas13d非目标效应的评估（B-D. FACS分析；E-G. 逆转录qPCR）

心脏电生理特性的调整hpCas13d治疗还对心脏电生理特性产生了积极影响。在Myh6R872H/+模型中，hpCas13d治疗后，心电图显示QTc间期缩短，S波幅度增大，表明心脏冲动传导得到改善。

复合杂合模型中的治疗效果在Myh6R872H/R404Q复合杂合模型中，hpCas13d的应用显著减轻了心脏肥厚，左室后壁厚度（舒张末期）从（1.28±0.18）mm降低到（0.92±0.15）mm，左室收缩末期内径从（1.70±0.19）mm降低到（1.17±0.12）mm，射血分数从（55.7±3.4）%提高到（74.77±7.86）%。此外，心电图分析显示，hpCas13d治疗显著改善了心脏冲动传导，PR间期、QRS间期和校正后的Q-T间期均得到正常化。

病理学特征的改善组织学分析进一步证实了hpCas13d的治疗效果。在Myh6R872H/R404Q模型中，hpCas13d治疗显著减少了心肌细胞的横截面积，改善了肌纤维的排列，并减少了纤维化和细胞凋亡，这表明hpCas13d不仅改善了心脏的结构和功能，还对心肌细胞的病理学特征产生了积极影响。

总结本研究开发了一项独特的hpCas13d系统，不仅在体外显示出对MYH7变异RNA的高精准切割能力，而且在体内模型中证明了其治疗HCM的有效性。这项研究不仅填补了领域内的治疗空白，还为其他遗传性疾病的基因治疗提供了新的策略。通过精确的等位基因特异性敲减，hpCas13d减少了非目标RNA的切割，从而降低了潜在的副作用风险。此外，本研究还为理解和治疗由多个病理变异引起的复杂遗传疾病提供了重要的见解，这对于未来精准医疗的发展具有深远的影响。

参考文献：Yang P, Lou Y, Geng Z, et al. Allele-Specific Suppression of Variant MHC With High-Precision RNA Nuclease CRISPR-Cas13d Prevents Hypertrophic Cardiomyopathy. Circulation[J]. 2024 May 16. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.123.067890.