尽管人们对肝脏纤维化的细胞和分子机制有了越来越多的了解，但目前尚无批准用于治疗肝纤维化的西药。间充质干细胞（MSCs）作为一种多能祖细胞，是治疗组织损伤和炎症的有吸引力的治疗手段。近日，一项发表于Hepatology International的研究确定了人脐带血来源的MSCs（UC-MSCs）对硫代乙酰胺（TAA）诱导的肝纤维化的保护作用及其机制。
研究者通过腹腔注射TAA诱导小鼠肝纤维化，随后通过尾静脉给部分小鼠注射UC-MSCs或UC-MSCs衍生的外泌体（UC-MSCs-Exo），取肝脏组织进行组织学分析。
UC-MSCs和UC-MSCs-Exo的鉴定与表征研究者从人脐带组织中分离出UC-MSCs，呈纺锤形，具有贴壁生长的特性，能分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。流式细胞术分析显示，UC-MSCs高表达CD90、CD105和CD73，而几乎不表达CD34、CD19、CD45和HLA-DR。
通过透射电子显微镜观察从UC-MSCs中成功分离出的UC-MSCs-Exo，观察结果显示，纯化后的外泌体呈典型的盘状形态，被脂质双层膜包裹，平均直径范围在30~150 nm之间，表达Alix和CD9，而不表达Calnexin。
可减少TAA诱导的肝脏炎症并改善肝功能研究者在TAA诱导的小鼠肝纤维化模型中评估了分离的UC-MSCs-Exo的有效性。苏木精-伊红（H&E）染色显示，与对照小鼠相比，TAA处理的小鼠肝脏组织中炎性细胞浸润显著增加。而UC-MSCs或UC-MSCs-Exo治疗的小鼠肝脏中炎性细胞浸润明显减少（图1a）。生化分析显示，UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗后，小鼠血清ALT和AST水平显著降低（图1b、1c）。
随后，研究者通过qRT-PCR检测了肝脏组织中促炎介质的表达。与PBS处理的对照组相比，UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗降低了肝脏组织中促炎细胞因子和趋化因子（包括TNF-α、IL-6和Mcp-1）的mRNA水平（图1d~1f）。同时，UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗组肝脏中Adgre1的表达也显著降低（图1g）。因此，UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗均改善了肝功能并减轻了肝脏炎症。
图1. UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗可减轻TAA诱导的小鼠肝脏炎症并改善肝功能 （源自文献）
可减轻肝纤维化天狼星红染色和Masson三色染色显示，与对照组相比，UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗组小鼠的胶原沉积显著减少（图2a、2b）。α-SMA是肝纤维化和肝星状细胞（HSC）激活的一个特异性标志物，免疫荧光染色显示，UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗后α-SMA表达明显降低（图2c）。同时，研究者通过qRT-PCR检测了肝脏组织中编码纤维化因子的基因（包括Acta2、Col1α1、Col3α1和Timp1）的mRNA水平，结果显示，这些基因在UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗组中的表达显著降低（图2d~2g）。这些结果表明，无论是UC-MSCs还是UC-MSCs-Exo治疗均显著减轻了TAA诱导的小鼠肝纤维化。
图2. UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗可减轻肝纤维化 （源自文献）
可抑制纤维化肝脏中SMO的表达GEO数据库分析显示，TAA诱导的小鼠肝纤维化模型中肝脏组织SMO的mRNA水平显著高于对照组。然而，在恢复后的肝脏中，SMO表达显著降低（图3a）。进一步分析显示，肝脏中SMO的mRNA水平与Col1α1和Acta2的mRNA水平呈正相关（图3b、3c）。
通过Western blot分析肝脏组织中的SMO蛋白水平，结果显示TAA处理后肝脏中SMO表达增加，而UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗后SMO表达显著降低（图3d）。免疫荧光染色进一步证实，UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗显著抑制了肝脏中SMO的表达（图3e）。这些结果表明，UC-MSCs和UC-MSCs-Exo通过抑制SMO表达来发挥治疗作用。
图3. UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗可抑制纤维化肝脏中SMO的表达 （源自文献）
UC-MSCs-Exo通过抑制Hedgehog/SMO通路抑制HSC激活研究者通过体外实验进一步研究了UC-MSCs-Exo抗纤维化作用与Hedgehog/SMO通路之间的关系。Western blot分析显示，TGF-β处理后LX2细胞中α-SMA表达显著上调，而UC-MSCs-Exo治疗显著抑制了α-SMA的表达。同时，UC-MSCs-Exo治疗降低了LX2细胞中SMO和Gli1的表达。免疫荧光染色结果一致，UC-MSCs-Exo治疗抑制了LX2细胞中α-SMA、SMO和Gli1的表达。此外，UC-MSCs-Exo治疗降低了LX2细胞中Hedgehog靶基因（包括Ptch1、Gli1和Cyclin D1）的mRNA水平。研究者进一步用SMO激动剂SAG预处理LX2细胞，结果显示，UC-MSCs-Exo介导的HSC激活抑制被SAG处理逆转。
UC-MSCs-Exo的治疗效果在体内被SAG处理逆转为了在体内进一步证实UC-MSCs-Exo通过靶向Hedgehog/SMO信号通路减轻肝纤维化，研究者在TAA诱导的纤维化小鼠中注射了SMO激动剂SAG。H&E染色和血清ALT/AST水平生化分析显示，与仅接受UC-MSCs-Exo治疗的小鼠相比，SAG+UC-MSCs-Exo处理组小鼠的肝损伤增加，并伴随促炎介质（包括TNF-α、IL-6、Mcp-1和Adgre1）表达的增加。天狼星红染色和Masson三色染色显示，SAG处理逆转了UC-MSCs-Exo在TAA诱导的纤维化小鼠中的抗纤维化作用。同时，研究者检测了肝脏组织中编码纤维化因子的基因表达，结果显示SAG+UC-MSCs-Exo处理组小鼠中Acta2、Col1α1、Col3α1和Timp1的mRNA水平显著上调。
总的来说，该研究表明UC-MSCs-Exo通过抑制Hedgehog/SMO信号通路发挥对肝纤维化的治疗作用。
参考文献：Zong R, Zheng Y, Yan Y, et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes alleviate liver fibrosis by targeting Hedgehog/SMO signaling. Hepatol Int. Published online August 13, 2024. doi:10.1007/s12072-024-10717-y
