文|面包夹知识

编辑|面包夹知识

«——【·前言·】——»

循环水养殖系统（Recirculating，aquaculture，systems，RAS）是一种集约化的水产养殖模式。

旨在保持良好的水质，其重要特点是由一系列水处理，单元组成，可回收高达90%以上的水，生物滤池作为RAS水处理技术的关键环节。

利用共存的异养，菌与自养菌去除来自粪便和残饵的含氮废物并降解有机物，这些细菌相互作用，在生物滤池内形成，一个微生态系统，对维持RAS的稳定性和提高系统，的承载力起十分重要作用。

生物滤池不同于RAS内其他水处理单元，因为，其功能发挥依赖微生物，使得其挂膜形成过程需要，一定的时间。

了解生物滤池中微生物群落演替过程，不但对生物滤池的稳定运行至关重要，还能够促进，我们对水处理过程中生物膜发育-功能联系的理解为，改进生物滤池的设计提供依据。

目前大多数，研究集中在生物过滤器的性能变化，或生物膜的形态变化上。

科研人员研究发现，聚乙烯介质，中孔隙的存在有利于隙内生物膜的生长，例如，上海某科研人员，在RAS生物滤池自然挂膜启动过程的研究中发现。

随着时间增加，载体表面附着物形态由黏性变为絮状，再变为菌胶团，经流水冲洗，生物膜颜色基本，没有改变。

而关于拟穴青蟹RAS，生物滤池启动过程中的微生物群落演替尚未，见研究报道。因此，本研究采用16SrRNA基因高通量测序技术，研究拟穴青蟹RAS生物滤池启动过，程中细菌群落的变化。

采用多种生物信息学分析方，法研究生物膜细菌群落的组成结构与功能，为了解，拟穴青蟹。

RAS，生物滤池启动过程中细菌群落的结构和功能特征变化提供参考，以设计适合拟穴青蟹，RAS养殖的生物过滤器。

«——【·材料与方法·】——»

本实验为期50d，拟穴青蟹幼蟹在盐度为，11的海水中暂养，1周后挑选四肢健全且活力良好的幼蟹，平均体质量为（13.06，±，0.45）g。将幼蟹随机分成6组即6个重复每组40只幼蟹，放置于养殖。

在篮（220mm×150mm×110mm）内进行养殖，随机分布到装有海水的，6个养殖池（1.0，m×1.0m×0.65m）中，每个养殖池水深保持在，40cm。

天然海水经砂滤池沉淀后，用漂白粉消毒，经过曝气检测没有余氯残留再使用，每个养殖池配备4个气石充氧，再外接一个过滤装置和一个体积为30L的生物滤池，生物滤池内装有，K3，聚乙烯填料。

实验正式开始时启动RAS，系统设计的水循环量为1，m3/h，每天循环60次。养殖期间，水温控制在(29±1)℃盐度控制在11~12溶氧量≥5mg/L每天补充2%因蒸发流失的海水。

每天定时投喂青蟹膨化配合饲料，投喂量为幼蟹体质量的3%定期对养殖池进行吸污，及时清除死蟹并做记录。

在养殖期间的2、5、10、20、30、40、50d采用五点取样法采集养殖池中的水样，装入取样瓶中待测。同上述时间点采集生物膜和水体的微生物样品。

用0.22μm的水系醋酸纤维滤膜抽滤水样，抽滤结束后滤膜上收集的为水体微生物样品。在每个生物滤池的上中下位置取6个填料。

用超声波清洗机超声15min后，再用滤膜抽滤水样，抽滤结束后滤膜上收集的为生物膜微生物样品，将滤膜保存至无菌无酶冻存管中，放置于-80，℃冰箱保存。

使用，HACH试剂盒检测氨氮、亚硝态氮、硝态氮、总氮质量浓度，使用总有机碳分析仪（TOC-VCSHJapan）检测TOC质量浓度。

使用便携式手持溶氧仪检测溶解氧（DO）质量浓度，使用温度计检测温度，使用pH计检测pH值，参考公式计算分子氨质量浓度。

对生物膜和水体样本进行，16SrRNA基因高通量测序分析，采用细菌通用引物扩增细菌区。

采用软件对序列进行质控、去噪、拼接、嵌合体去除，将相似性达到100%的序列聚为一个分类操作单元（ASV），去除所有不属于细菌域的ASV，在不同分类学水平上注释细菌群落的物种信息。

分别以每一时间点的水体微生物和生物膜微生物互为来源做，FEAST，分析，其中“前期水体”和“前期生物膜”为作为来源时间点之前的时间点的水体微生物和生物膜微生物。

使用SPSS25.0软件对实验数据进行处理，采用单因素方差分析判用多重比较法检验。

«——【·结果·】——»

在本研究中，整个时间段的水质参数变化显著。氨氮质量浓度从，2d到10d，呈显著上升趋势（P<0.05），从10d到50，d总体呈下降趋势（图1）。

分子氨质量浓度从呈显著上升趋势，10d后显著下降（P<0.05），20d到50d则保持稳定，亚硝态氮质量浓度在前20，d呈显著上升趋势（P<0.05），从30d到50d，呈显著下降趋势（P<0.05）。

硝态氮和总氮在实验结束时（50d）积累（图1）。TOC质量浓度在前10d保持稳定从10d到50d呈先显著升高后显著下降趋势（P<0.05）。

由图2可知香农指数、Chao指数呈先上升后下降，最终趋于平缓的趋势，且均在，10d达到最高值。

基于Bray-crutis的主坐标分析得出主坐标1和主坐标2对样本的贡献率分别为60.2%和16.3%（图3）20、30、40、50d的细菌群落聚在一起，并且与其他时间点的细菌群落存在显著差异（P<0.05）（图3）。

采用典型相关分析判断环境因子与细菌群落组成之间可能存在相关性。

从图4可知，总氮和硝态氮质量浓度对细菌群落组成的影响最大，它们分别与，20，d到，30d的细菌群落的相关性最强。

此外，pH、温度、TOC、氨氮和分子氨质量浓度与细菌群落呈正相关。

DO、硝态氮、亚硝态氮和总氮质量浓度与细菌群落呈负相关20d到50d的细菌群落和2d到10d的细菌群落情况相反。

分别对生物膜细菌群落分类水平丰度占前10的门、科、属进行分析。结果表明，在门水平上（图5），生物膜富集占绝对优势的变形菌门（Proteobacteria）平均相对丰度57.1%）和拟杆菌门。

它们的相对丰度在各个时间点都占1%以上在属水平上，生物膜富集占绝对优势的食氢产水菌属（Hydrogenophaga）（15.1%），其次为鼠尾菌属（Muricauda）（5.7%）和海神单胞菌属（Neptunomonas）（4.3%）等。

本研究中通过，FAPROTAX，软件对生物膜菌群功能进行预测，共鉴定出20个功能基团，这远远少于一些传统的处理生活污水的生物滤池。

«——【·讨论·】——»

水质是评价RAS生物滤池功能的重要指标"，在本研究中，氨氮和亚硝态氮质量浓度分别在10和30d以后显著下降(P<0.05)，亚硝态氮质量浓度下降滞后于氨氮。

其主要原因是在海水体系细菌群落的建立过程中，异养细菌和氨氧化细菌对氧的争夺能力要强于硝化细菌，且硝化菌群对负荷变化的适应较慢。

硝态氮的去除主要通过微生物的反硝化作用，该过程主要由兼性厌氧微生物起作用，但由于RAS的曝气环境。

生物滤池内溶解氧质量浓度较高，导致生物滤池的反硝化作用在一定程度上被抑制，造成硝态氮积累，硝态氮的积累导致总氮积累。

虽然硝态氮物质量浓度呈增长趋势，但低浓度范围内不会对拟穴青蟹造成危害。

随实验进行，水体分子氨和亚硝态氮质量浓度降低、硝态氮质量浓度升高，表明生物滤池中构建的硝化菌群已经建立。

生物滤池也可通过异养菌作用去除水体中的TOC"，在本研究中，TOC质量浓度在前40d均维持了较高水平。

研究表明，只有通过反硝化作用才能从水产养殖系统中完全去除含氮化合物。

其中，napA基因编码的细胞周质硝酸盐还原酶能介导同化氮还原和异化氮还原反应，将硝酸盐异化还原为铵，降低水体中的硝酸盐水平，该酶可以在好氧和厌氧环境中都发挥作用，可以作为研究反硝化菌的分子生态学常见的分子标记物。

在本研究，生物膜细菌群落的napA，基因整体呈上升趋势，有利于降低养殖水体中的硝酸盐含量。

此外，本研究中FEAST，分析结果表明生物膜细菌和水体细菌存在相互交换的现象，且主要贡献来自自身前期细菌。

随时间增加，生物膜细菌来自本身细菌的贡献率升高，到后期趋于稳定。

«——【·结语·】——»

启动过程中的水质指标变化显著，氨氮、分子氨和亚硝态氮质量浓度总体呈先上升后下降趋势，硝态氮和总氮在，50d积累且总氮和硝态氮质量浓度对生物膜细菌群落变化的影响最大。

生物膜的细菌群落结构和功能随着时间增加变化显著，基于功能预测结果发现生物膜功能主要富集在氮循环和有机物降解这两方面。

生物膜碳循环和氮循环绝对基因拷贝数随时间增加总体呈增加趋势，有利于降低TOC、氨氮和亚硝态氮质量浓度，且与功能预测结果一致。

生物膜细菌来自本身细菌的贡献率也逐渐升高，到后期趋于稳定。