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胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是一种有效的降血糖药物，可以修复胰腺β细胞并促进胰岛素分泌。但GLP-1稳定性较差，缺乏靶向能力，难以到达作用位点发挥药效。
近期，郑州大学的张振中教授和侯琳团队将表达GLP-1的质粒引入大肠杆菌Nissle 1917（EcN）中，并通过在其表面上的简单自组装形成脂质膜，从而产生能够抵抗胃肠道恶劣环境的口服给药系统（LEG，方案1）。该系统利用益生菌的趋化特性在胰腺部位实现高效富集，并通过调节免疫细胞的平衡保护胰岛β细胞免受破坏。
相关研究成果以“Biochemotaxis-oriented engineering bacteria expressing GLP-1 enhance diabetes therapy by regulating the balance of immune”为题于2024年1月22日发表在《Advanced Healthcare Materials》上。
方案1 LEG制剂抗二型糖尿病（T2DM）调理机制示意图
1. LEG的制备及表征
DLPC基类脂膜用于包裹EcN并通过薄膜分散法制备（图1a）。1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）和胆固醇分别用于延长循环时间和增强腿的稳定性。在EcN-GLP-1涂层脂质膜（LEG）的形成过程中，加入钙离子以促进脂质膜在EcN表面的自组装。TEM和LSCM证实了脂质膜可以以自组装的方式有效地修饰在EcN表面（图1b-c）。由于益生菌在GIT环境中容易失活，因此在模拟胃液（SGF）、肠液（SIF）和胰液（SPF）中研究了脂质膜涂层对EcN的保护功能（图1d）。如图1e所示，质膜包衣显著增强了EcN对酸性胃环境的耐受性。在SIF中观察到类似的现象，进一步证明了与EcN相比，LEG的耐受性提高。同样，在模拟SPF后，LEG的菌落计数显著高于EcN。总之，这表明LEG提高了益生菌对胃肠道微环境的耐受性，为胰腺蓄积奠定了基础。
图1 LEG的制备和表征
2. LEG的体内行为
之后，研究者对T2DM小鼠胰腺中的LEG积聚进行了评估。与未涂布的EcN相比，小鼠胰腺中LEG的存活率有显著差异（图2a）。由此可见，脂膜的保护可以大大提高EcN在胃肠道中的存活率，而益生菌存活率和定植率的提高是促进更多EcN通过十二指肠进入胰管并最终迁移至胰腺的关键因素。此外，观察到脂膜的保护有效地增强了EcN在肠道中的保留（图2c）。生物透射电子显微镜显示，在LEG组的胰腺部位出现了明显的细菌形态，进一步证实了胰腺中EcN的位置增加（图2d）。这些发现表明，脂质膜可以有效地保护益生菌免受胃肠道攻击，并显著提高EcN的存活率和保留率，为益生菌进一步输送到胰腺提供了优势。免疫荧光分析表明，LEG是一种有前途的口服给药载体，可改善GLP-1的稳定性、转运和胰腺蓄积（图2e）。
图2 口服给药后T2DM小鼠胰腺中的LEG蓄积
3. 调理效果的体内评估
随后，在T2DM小鼠身上评估了基于LEG的制剂的体内性能（图3a）。如图3b-c所示，调理8周后，LEG组T2DM小鼠的BGL从15.4±2.8 mmol L-1降至8.7±0.7 mmol L-1，接近正常血糖水平，与ES组无明显差异。腹腔葡萄糖耐量试验结果表明，DL和EcN的调理效果有限，不能逆转高血糖症，而LEG可以控制血糖（图3d）。T2DM小鼠的胰岛素水平结果显示：LEG能够有效地刺激胰岛素的分泌，并且在ES组和LEG组之间没有发现胰岛素的显著差异（图3e），可能的原因是LEG可能恢复了胰岛β细胞的功能。此外，LEG对氧化应激的下调效果最好，有效改善了T2DM小鼠胰腺氧化应激的微环境（图3f-g）。
图3 LEG的抗T2DM效应
4. 体内微环境变化的评估
白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）是与T2DM发病机制相关的主要促炎细胞因子，可导致胰岛β细胞功能紊乱。酶联免疫吸附试验的定量结果显示T2DM小鼠的血清IL-6和TNF-α水平显著上调，但在ES和LEG调理后显著下降（图4c）。这一现象与上述免疫细胞调节的结果一致，表明LEG可以通过调节免疫细胞的平衡和抑制促炎细胞因子（IL-6和TNF-α）的分泌来改善炎症微环境，从而促进胰岛素分泌（图4d）。
T2DM常常伴有肝脏脂肪变性和甘油三酯（TG）以及胆固醇（CHOL）的升高，不同处理后TG和CHOL均降低（图4e）。肝功能指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸草酰乙酸转氨酶（AST）也恢复到正常水平（图4f），结果表明LEG可以有效降低T2DM小鼠的血脂并预防并发症。此外，在胰腺中没有观察到微生物群，表明益生菌疗法不会诱导潜伏的细菌驻留（图4g）。
图4 调理后炎症微环境的变化
5. LEG的抗T2DM机制探讨
采用定量蛋白质组学技术研究LEG抗T2DM病毒的详细机制。如图5a-b所示，共鉴定出5421种蛋白质。其中，LEG调理后胰腺中有53种蛋白质上调，45种蛋白质下调。通过基因本体（GO）分析，蛋白质通常被分为三类（生物过程、细胞成分和分子功能）（图5c）。该分析揭示了生物过程，包括甘油三酯分解代谢和代谢过程的正向调节、脂蛋白脂肪酶以及甘油三酯脂肪酶活性，对细胞功能至关重要。据报道，高血糖常伴有脂质代谢异常。如图5d-e所示，与胰岛β细胞功能密切相关的信号通路（胰岛素分泌和AMPK信号）在LEG调理后显著上调，表明LEG不仅可以有效降低血糖，还可以调节合成和代谢平衡，这有助于进一步维持葡萄糖稳态。
图5 LEG的抗T2DM机制
综上，本文开发了一种长效口服GLP-1制剂，以实现彻底的T2DM调理。发现该制剂可以维持体内GLP-1的浓度和活性，导致长期血糖控制和胰岛β细胞恢复。此设计将药物和益生菌结合在一个简单的给药系统中来调理糖尿病，通过口服给药呈现出每两天一次的给药方案。这一策略为将调理性生物制剂口服递送至糖尿病调理的靶向位点提供了潜在的平台。
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