编者按
湿性老年黄斑变性是老年人丧失中心视力的最主要原因，近年来国内外围绕其诊治新策略的探索研究层出不穷，成果璀璨。中华医学会第二十八次眼科学术大会（CCOS2024）上，四川大学华西医院陆方教授团队刘桂娜博士报告了一项尖吻蝮蛇毒腺C5aR1结合多肽G23对湿性老年性黄斑变性的作用探究，为湿性老年黄斑变性的治疗带来新的启示。
本研究使用尖吻蝮蛇毒腺T7噬菌体文库筛选与人C5aR1蛋白结合的多肽，通过三轮筛选、序列比对、多肽生物信息学预测、多肽合成、细胞筛选等获得C5aR1结合多肽G23，并通过细胞实验、小鼠动物模型探究G23的抗炎、抗新生血管的作用。
研究者们具体进行了以下工作
尖吻蝮蛇毒腺T7噬菌体文库中C5aR1蛋白结合多肽的筛选。
采用Expasy、AlphaFold Server、Hdock预测多肽G23的结构与性质。
采用Fmoc固相肽合成法合成多肽G23。
通过人重组蛋白C5a刺激ARPE-19、LPS刺激iBMDM检测多肽G23的抗炎作用。
构建激光诱导脉络膜新生血管（CNV）小鼠模型并探究G23抑制CNV的作用。
研究结果
01
尖吻蝮蛇毒腺中C5aR1结合多肽筛选与测序
酶标板包被C5aR1蛋白后，经过三轮筛选，获得与C5aR1蛋白特异性结合的噬菌体。挑选噬菌体克隆菌斑进行PCR，将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，所获多肽对应的DNA片段大部分为100~750bp。回收PCR产物测序得115有效序列，90条序列有对应蛋白注释，主要为金属蛋白酶、核糖体蛋白。
图1.单克隆菌斑PCR示意图
表1.90条序列对应蛋白注释
02
G23性质与结构预测
在115条序列中，有一序列为‘5- AAT TCT ACG CCC CGT GGT GTG GCC ACT GCA AGA ATC TTG AAC CCA AAT ACA AGG AAC TGG GGG AGA AGC-3’，其blast结果为：PREDICTED: Protobothrops mucrosquamatus protein disulfide isomerase family A member 3 (PDIA3), mRNA。序列ID：XM_015818598.2，匹配范围：1277-1345，匹配度评分为：128 bits(69)，匹配度E值为：1e-25，相似度为69/69(100%)，间隔为：0/69(0%)。其对应氨基酸序列为NSTPRGVATARILNPNTRNWGRS，分子式为C106H176N40O33，共有355个原子，分子量为2538.81，论等电点为12.48，protein-sol网站预测G23的可溶性值为0.729，远大于0.45，表明G23的溶解性良好。
图2. AlphaFold Server预测G23的三级结构示意图。从左往右依次为卡通模型、棍棒模型、表面模型。
图3.G23与C5aR1蛋白分子对接示意图。绿色为G23氨基酸棍棒模式图，亮红色、黄色、紫色、粉色均为C5aR1氨基酸棍棒模式，C5aR1中顺序相近的氨基酸分子用同一颜色表示、顺序较远则用不同颜色（亮红色、黄色、紫色、粉色）进行区分。
03
采用Fmoc固相肽合成法合成多肽G23
根据组成G23的每个氨基酸的分子量之和减去形成脱水肽键的分子量，最终计算出G23 的理论分子量大小为2538.801Da。HPLC 测定的纯度为99.297%。
图4.HPLC 测定G23纯度
04
G23体外抗炎作用探究
10ug/ml的G23能够有效降低50nM人重组C5a蛋白对ARPE-19细胞的刺激。浓度大于1.0ug/ml的G23能够有效减少LPS刺激iBMDM细胞产生的NO。
图6.RT-qPCR检测G23对C5a刺激ARPE-19细胞的作用（n=4）
图7.G23对LPS刺激iBMDM炎症的作用（n=4）
05
G23对激光诱导CNV的作用探究
使用波长532 nm、直径50μm、持续时间70ms、功率260MW的绿色Argon 86激光脉冲构建小鼠脉络新生血管模型，连续皮下7天注射不同浓度G23溶液（PBS缓冲液、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg），发现1.0mg/kg的G23溶液能够有效减轻激光诱导的脉络膜新生血管渗漏程度和降低新生血管病灶面积约37.63%（P=0.0296）, 2.0mg/kg的G23能减少35.27%脉络膜新生血管面积（P=0.0553）。
图8 .激光后第六天小鼠眼底照相与FFA图像展示
图9.连续皮下注射不同浓度G23后，RPE-脉络膜复合体荧光铺片展示图（5x和20x）
图10.连续皮下注射不同浓度G23后，CNV渗漏等级评价统计图（左），RPE-脉络膜复合体荧光铺片后CNV面积统计（右）。n=6~7/23~26，*: P<0.05, ****: P<0.0001。
