引言

这是一个关于在微观尺度上博弈的故事，一场发生在纳米世界的攻防战。对于我们而言，单纯疱疹病毒（HSV）是一个古老而顽固的对手。尽管我们早已拥有了阿昔洛韦这样经典的药物，但耐药性的出现迫使我们寻找新的武器。解旋酶-引物酶抑制剂（HPIs）被寄予厚望，但它们究竟如何卡住病毒齿轮？为什么对某些病毒无效？

12月29日，《Cell》的研究报道“Mechanisms of HSV-1 helicase-primase inhibition and replication fork complex assembly”，该研究利用冷冻电镜和单分子光镊，以前所未有的分辨率揭示了这些谜题。

单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus, HSV）是一个古老而顽固的对手。一旦感染，它便在我们的神经节中潜伏终生，伺机而动。尽管我们早已拥有了阿昔洛韦（Acyclovir）这样经典的核苷类似物药物，但耐药性的出现以及对潜伏病毒的无力，迫使我们必须寻找新的武器。

解旋酶-引物酶抑制剂（Helicase-Primase Inhibitors, HPIs）被寄予厚望。Pritelivir 和 Amenamevir 是其中的佼佼者，它们不再针对DNA聚合酶，而是瞄准了病毒复制的“解旋引擎”。然而，这些药物究竟是如何卡住病毒齿轮的？为什么它们对某些疱疹病毒有效而对其他的无效？病毒的复制机器又是如何在拥挤的细胞核内精准组装的？

这些问题困扰了学界多年。直到这项重磅研究的出现，研究人员利用冷冻电镜（Cryo-EM）、单分子光镊（Optical Tweezers）以及分子动力学模拟，以前所未有的分辨率揭示了HSV-1解旋酶-引物酶复合体被药物锁死的细节，并首次解析了完整的病毒复制叉复合体结构。

要理解药物如何起作用，先来看看靶点的模样。HSV-1的解旋酶-引物酶复合体（H/P complex）是病毒复制的核心机器，由三个亚基组成：UL5（解旋酶）、UL52（引物酶）和UL8（辅助蛋白）。这是一个兼具解开DNA双链和合成RNA引物功能的“多面手”。

研究人员首先利用哺乳动物细胞表达系统，纯化出了高质量的HSV-1 H/P复合体。在质量光度法（Mass Photometry）的检测下，主要粒子的质量集中在 293 kDa 附近，这与UL5/UL52/UL8异源三聚体的理论质量高度吻合。

为了捕捉这个复合体在工作状态下的样子，研究人员构建了一个模拟的DNA复制叉底物，并加入了抑制剂Pritelivir。冷冻电镜技术再次展现了其强大的威力，研究团队成功解析了结合DNA和Pritelivir的H/P复合体结构，整体分辨率达到了 3.7 Å，而在核心区域，通过聚焦细化处理，分辨率更是提升到了 3.3 Å 至 3.4 Å。

在微观视野下，这个复合体呈现出一个双叶状的架构，UL52引物酶位于中心，像身躯一样连接着位于两侧的UL5解旋酶和UL8辅助蛋白。这是一个极其复杂的分子机器：

UL5解旋酶：属于超家族1（SF1）解旋酶，它拥有典型的RecA样结构域（1A和2A），这是它利用ATP水解能量驱动DNA易位的核心引擎。

UL52引物酶：则拥有一个古菌-真核引物酶样结构域（AEP-like domain），负责合成RNA引物，同时它的C末端还有一个锌指结构域（ZnF）。

UL8：虽然被预测像一个失去活性的B族DNA聚合酶，但在这个复合体中，它通过其“拇指”结构域与UL52紧密抱团，起到了至关重要的结构支撑作用。

最令人着迷的是DNA在这个机器中的穿行路径。结构显示，单链DNA（ssDNA）穿过由UL5的1A和2A结构域形成的峡谷，这与所有SF1解旋酶的特征一致。然而，药物Pritelivir并没有直接堵住DNA的通道，而是选择了另一个更巧妙的位置——它结合在UL5的1A与2A结构域之间，同时通过其吡啶环（pyridine ring）插入到一个深邃的口袋中。

不仅仅是Pritelivir，研究团队还解析了另外两种HPIs——Amenamevir（已在日本获批上市）和IM-250（正处于临床试验阶段）的结合结构，分辨率分别高达 2.8 Å 和 2.9 Å。这三种化学结构迥异的药物，竟然殊途同归，都楔入了同一个关键的界面。这不仅仅是简单的结合，这是一种“分子锁定”。

解旋酶要工作，必须动起来。SF1解旋酶的工作原理类似于一只“尺蠖”：在ATP结合和水解的驱动下，两个RecA样结构域（1A和2A）会发生开合运动，从而拉动DNA链向前移动。

然而，HPIs的介入彻底破坏了这种节奏。通过将药物结合状态的结构与AlphaFold 3预测的ATP结合态结构进行比对，研究人员发现了一个惊人的差异。在ATP结合状态下，UL5的2A结构域应该向1A结构域靠拢，处于一种“闭合”构象，这样才能催化ATP水解。

但是，当Pritelivir、Amenamevir或IM-250存在时，它们像一个坚硬的楔子，卡在1A和2A结构域之间。具体的数据展示了这种构象变化的剧烈程度：在药物结合态下，2A结构域中的α13螺旋和α29螺旋，相对于它们在ATP结合态的位置，分别发生了 2.8 Å 和 3.6 Å 的位移。

这种位移是致命的。它使得负责协调ATP γ-磷酸基团的关键残基——R345和R841，被迫远离了它们的工作岗位。换句话说，药物将解旋酶锁定在了一种“开放”且“非活性”的构象中。解旋酶虽然结合了DNA，甚至可能结合了ATP，但它无法通过结构域的闭合来挤压ATP进行水解，也就无法产生机械力。

为了验证这一结构生物学的推论，研究人员进行了ATP水解酶活性实验。结果毫无悬念：Pritelivir和Amenamevir都以剂量依赖的方式显著抑制了HSV-1 H/P复合体的ATP水解活性。这不是简单的竞争性抑制，而是一种变构抑制——通过锁死蛋白质的构象，让酶彻底“瘫痪”。

更有趣的是，这种抑制模式不仅影响了解旋酶，似乎也波及了引物酶。在结构图中，我们看到药物结合的口袋实际上是由UL5和UL52共同构成的。药物的一部分基团深深嵌入UL52的N端结构域（NTD）和中间结构域形成的凹陷中。这暗示了HPIs是一类“界面抑制剂”，它们利用并稳定了亚基之间的特定相互作用。

结构生物学提供了一张清晰的静态照片，但生命过程是动态的。为了确证HPIs在毫秒尺度上对解旋酶运作的影响，研究团队引入了高精度的单分子光镊技术（Optical Tweezers）。

这是一个极具挑战性的实验设计。研究人员将一根长约17.7 kb的DNA分子悬挂在两个微米级的聚苯乙烯微球之间，通过激光捕获这些微球并施加恒定的拉力（45 pN）。当解旋酶解开双链DNA时，双链变为单链，在拉力作用下DNA的总长度会增加。通过实时监测两个微球之间的距离变化，就可以直接读出解旋酶的工作状态。

在没有药物存在时，野生型HSV-1 H/P复合体表现得相当勤奋。它以平均每秒 33个核苷酸（33 nt/s）的速度持续解开DNA，过程中几乎没有任何停顿。然而，当Pritelivir加入战局，情况发生了戏剧性的变化：

• 100 nM 浓度：平均解旋速度下降到了 25 nt/s，更重要的是，它开始出现“停顿”（Pausing），停顿时间占到了总时间的 17.9%。

• 200 nM 浓度：速度进一步跌至 17 nt/s，停顿比例上升至 25.6%。

• 500 nM 浓度：解旋酶几乎步履维艰，速度仅剩 9.5 nt/s，而停顿状态占据了超过一半的时间（51.5%）。

这些数据如实地描绘了药物的作用图景：HPIs并不是简单地让解旋酶“脱轨”或“解体”，而是让它在工作过程中频繁地陷入一种“僵死”的状态。每一次停顿，都对应着药物分子进入结合口袋，将1A/2A结构域锁死在开放构象的时刻。

为了进一步确认这种停顿确实是由药物结合特定位点引起的，研究人员测试了携带耐药突变的H/P复合体。UL5 K356N突变是一个经典的耐药突变，在500 nM Pritelivir存在下，该突变体的解旋速度依然保持在23 nt/s，停顿比例仅为4%，几乎与无药状态无异。同样，位于药物结合口袋边缘的UL52 F360R突变也表现出了强大的抗性。这些单分子层面的证据，强有力地支持了药物通过结合特定口袋诱导解旋酶进入非活性暂停状态的假说。

HPIs对单纯疱疹病毒（HSV-1和HSV-2）以及水痘-带状疱疹病毒（VZV），这些都属于α-疱疹病毒亚科，显示出了极佳的疗效。然而，对于属于β-疱疹病毒亚科的人巨细胞病毒（HCMV），这些药物却束手无策。

为什么？既然疱疹病毒家族的解旋酶-引物酶在进化上是高度保守的，为何药物会有如此明显的选择性？利用冷冻电镜解析的高分辨率结构，结合分子动力学（MD）模拟，研究团队解开了这个谜题。

在UL5解旋酶一侧，关键的接触残基（如K356, H349, M355等）在α、β、γ-疱疹病毒中都是高度保守的。特别是K356，它是药物结合的锚点。然而，差异出现在UL52引物酶一侧。在HSV-1中，UL52的F360（苯丙氨酸）残基与药物分子形成了关键的疏水相互作用。

关键发现：当我们把目光转向HCMV时，其同源蛋白UL70中，对应HSV-1 F360的位置变成了一个精氨酸（Arginine, R）。苯丙氨酸是疏水的芳香族氨基酸，而精氨酸是带正电的亲水氨基酸。这种性质的剧烈反转，彻底破坏了药物结合所需的疏水环境。

为了验证这一假设，研究人员在HSV-1的UL52中人为引入了“HCMV式”的突变——F360R。结果正如预期，这个突变让HSV-1 H/P复合体对Pritelivir产生了完全的抗性。这解释了为什么现有的HPIs无法治疗巨细胞病毒感染，也为未来的药物研发指明了方向：想要开发广谱药物，需要避开这些在亚科间变异较大的区域。

除了药物机制，这项研究的另一大亮点是解开了HSV-1复制叉组装的谜题。在病毒DNA复制过程中，解旋酶（负责开路）必须与DNA聚合酶（负责合成）紧密配合。长期以来，人们知道这两个复合物之间存在联系，但具体的物理接口在哪里？

研究团队尝试在体外混合这两个庞大的复合物，并加入一段模拟的Y字形复制叉DNA，成功利用冷冻电镜解析了这个分子量约为 494 kDa 的完整复制叉复合体。

这是一个令人惊叹的分子拥抱。聚合酶UL30并不是随意地靠在解旋酶上，它是通过其N端的一个特殊结构域——pre-NH2 terminal domain (preN)——与解旋酶UL5的2B和2C结构域发生了紧密的接触。在这个接触面上，研究人员发现了一个高度保守的氨基酸基序（Motif）。

FYNPYL 基序：在UL30的preN结构域中，有一段序列为“FYNPYL”（残基44-49）。这段序列像一只手，伸向了UL5解旋酶的表面。UL30的F44、Y48和L49分别与UL5的F550、Y648和Y696形成了紧密的疏水堆积。

这个“FYNPYL”基序在疱疹病毒中高度保守。为了验证这个接口的功能重要性，研究人员设计了一个巧妙的突变：将UL5上与FYNPYL基序相互作用的四个关键残基全部突变为丙氨酸（称为UL5_4ala突变体）。结果是毁灭性的。在体外滚环复制实验中，野生型的复制叉机器可以高效地合成超过 10 kb 的长链DNA。然而，一旦引入了UL5_4ala突变，DNA合成的效率急剧下降，几乎检测不到长链产物的生成。

在这个完整的复制叉结构中，我们还看到了DNA传递的路径。这就像一条精心设计的流水线。解旋酶UL5位于前方，像犁一样解开双链。分离出来的单链DNA（ssDNA）沿着一条带正电荷的沟槽，从解旋酶的出口直接流向了聚合酶UL30。

在沟槽中，UL30的残基通过氢键和堆积作用，像护栏一样引导着ssDNA的走向。这种无缝衔接的设计，最大限度地保护了脆弱的单链DNA，并确保了解旋与合成的速率匹配。这展示了病毒进化的极致效率：它不仅利用蛋白-蛋白相互作用（FYNPYL接口）来拉近酶的距离，还利用蛋白-DNA相互作用构建了物理通道。

这项发表于《Cell》的研究，为我们提供了一份关于HSV-1复制机器的详尽蓝图。从药物分子的微观锁定，到宏观复合体的动态组装，每一个细节都充满了生物化学的逻辑之美。

1 药物研发的新思路

既然我们已经看清了HPIs的结合模式和选择性来源，未来的药物设计将更加有的放矢。针对HCMV的耐药位点，是否可以通过修饰药物的侧链基团来恢复结合力？或者，针对关键的“FYNPYL”接口，设计一种多肽或小分子去破坏这个“握手”过程，这将是一类全新的复制抑制剂。

2 基础研究的力量

从发现FYNPYL基序的保守性，到解析其在复制叉中的结构功能，再到解释其在动物模型中的表型，这一连串的证据链展示了基础研究如何层层递进地揭示生命现象的本质。病毒的每一个原子都经过了亿万年的自然选择，理解它们，就是在解读进化的语言。

3 动态的生命观

Cryo-EM给了我们高分辨率的“照片”，而光镊给了我们高时间分辨率的“录像”。两者的结合，让我们看到了生命的真实状态——不仅有静态的结构堆积，更有动态的能量转换和构象互变。

单纯疱疹病毒或许永远潜伏在我们的神经节中，但在人类理性的显微镜下，它的每一个弱点都将无所遁形。随着我们对这些纳米机器理解的加深，终有一天，我们将掌握彻底锁死它们的方法。

参考文献

Yu Z, Sathyanarayana P, Liu C, Tan JMJ, Yang P, Das B, Hu S, Fan X, Ji C, Weller SK, Shekhar M, Coen DM, Kranzusch PJ, Loparo JJ, Abraham J. Mechanisms of HSV-1 helicase-primase inhibition and replication fork complex assembly. Cell. 2025 Dec 29:S0092-8674(25)01376-5. doi: 10.1016/j.cell.2025.11.041. Epub ahead of print. PMID: 41468884.

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