编者按

目前研究证实，乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合是慢性乙肝进展及肝癌发生的关键“隐形推手”之一。需要注意的是，整合DNA作为“基因组印记”稳定存在于宿主细胞中，现有核苷类似物或干扰素治疗虽然能抑制病毒复制，但尚无法彻底清除cccDNA和整合DNA序列，成为实现乙肝临床治愈及完全治愈的核心障碍。近日，在中华医学会第二十二次病毒性肝炎及肝病学术会议暨2025年中华医学会感染病学分会年会、中华医学会肝病学分会年会上，四川大学华西医院感染性疾病中心唐红教授就“乙肝病毒DNA整合的研究进展及临床意义”相关话题进行了精彩的学术报告。本刊特将报告内容整理如下，供读者参阅。

1980年，Nature杂志发表了一项里程碑式研究[1]，首次证实HBV DNA可整合到人类肝细胞基因组中，这一发现为揭示HBV的致病机制提供了关键线索。目前，HBV DNA整合已成为全球肝病研究的重要议题之一。最新数据显示，PubMed数据库收录的相关论文已达2602篇，其中中国学者贡献306篇，平均每篇被引用35.33次，展现出我国在该领域的研究深度与国际影响力[2]。

HBV DNA整合是指HBV的部分或全长基因组片段插入到宿主DNA中的过程，整合的HBV DNA来源于线性双链DNA（dslDNA）。总的来说，乙肝病毒DNA的整合过程遵循“复制错误-修复异常-整合发生”的三步逻辑链（图1）。这一过程始于病毒基因组的复制环节[3]：HBV病毒颗粒进入肝细胞后，松弛环状DNA（rcDNA）被修复形成共价闭合环状DNA（cccDNA），cccDNA转录生成前基因组RNA（pgRNA）；以pgRNA作为模板，逆转录合成HBV负链DNA，聚合酶准确转位则进一步合成HBV正链DNA形成松弛环状DNA（rcDNA）；如果聚合酶发生错误转位，则会导致线性双链DNA（dslDNA）的产生，而这正是病毒DNA整合入宿主染色体的关键中间体（图2）。

图1. HBV的生活史

（引自讲者幻灯）

图2. dslDNA的产生

（引自讲者幻灯）

目前较多研究认为，HBV整合的总体分布是随机的。但也有一些研究显示[4-6]，基因组上转录活跃的区域由于解旋过程失去了核小体的保护，更容易受到损伤和断裂。病毒整合可能更倾向于发生在基因富集区域，例如CpG岛、基因编码区和启动子区域，而并非完全随机分布（图3）。在HBV基因组中，整合通常发生在DR1或DR2位点附近，特别是在HBx基因的3’端和pre-C/C基因的5’端附近（大约1800处），整合的HBV片段大小范围从28 bp至3215 bp不等，其中长度为1500-2500 bp的片段出现频率明显高于其他长度的片段。

图3. HBV DNA整合在HBV基因组中的特点

（引自讲者幻灯）

当HBV DNA整合侵入宿主基因组时，整合可影响下游宿主基因的表达，当整合不断积累时，细胞会启动一种紧急修复机制。但这种修复如同“盲人拼图”，极易出错——病毒DNA与宿主染色体的断裂末端被错误连接，导致染色体片段断裂、倒位或易位。这些基因组结构的不稳定为后续的细胞病变埋下隐患[4,7]。

此外，病毒DNA整合后，常导致病毒基因的“残缺表达”，生成失去正常功能的截短病毒蛋白，其中截短型HBx过度表达可抑制细胞凋亡[8]，不能正确分泌的截短型HBsAg积累在内质网膜，可引起内质网应激和细胞氧化应激，进一步增加DNA损伤和双链断裂，反过来又增加了整合的概率[9]。

总之，HBV DNA整合主通过影响宿主基因的表达、改变染色体的稳定性、产生截短型病毒蛋白等在HCC的发生中产生作用，分析并理解这其中的分子机制具有重要意义。

近年来，乙肝病毒DNA整合检测技术经历了从低通量到高通量的跨越式发展（表1）。Southern Blot技术是最早的整合检测方法，但仅能检测高度扩增的克隆肝细胞，灵敏度较低。PCR技术的出现显著提升了检测灵敏度。其中，Alu-PCR利用人类基因组中Alu重复序列（占基因组11%）的分布特征，通过设计病毒特异性引物与Alu序列引物，特异性扩增病毒-宿主连接位点，使检测灵敏度提升至10-4水平。此外，随着全基因组测序（WGS） 技术的应用，改变了整合检测的格局。通过对肿瘤组织进行全基因组测序，研究者可在全基因组范围内无偏倚地识别整合位点，实现“一网打尽”。

表1. HBV DNA整合的检测手段

（引自讲者幻灯）

注：高度扩增的克隆肝细胞，是指某些肝细胞经历了异常的增殖过程，形成了数量异常增多的细胞群体（克隆群），常与病毒整合及癌变相关。

近年来，在探索HBV DNA整合的无创生物标志物过程中发现，肝癌和肝硬化患者血浆中的循环cfDNA中可检测到HBV整合，这种携带整合的cfDNA称为vh-DNA[10]。由于cfDNA主要来源于死亡的肿瘤细胞，非肝癌肝组织释放的cfDNA显著低于肝癌组织。因此，vh-DNA可用于监测肝癌进展过程中的HBV整合，也可以作为监测残余肿瘤细胞和预测复发的生物标志物（图4）。

研究显示，在肝癌患者中，血浆vh-DNA的检出率高达83%，而在肝硬化患者中仅为21%。这一显著差异提示，vh-DNA有望成为区分肝癌与良性肝病的精准生物标志物，帮助更早识别高风险人群[11-13]。

图4. vh-DNA监测残余肿瘤细胞和预测复发的效果评估

（引自讲者幻灯）

HBV感染过程中，病毒DNA整合并非静态事件，而是随着病毒复制活性与宿主免疫压力的变化呈现动态演变，不同感染阶段呈现出不同的整合特征（图5）。整合在HBV感染早期即可发生，HBV整合数量与肝脏炎症呈正相关，在HBsAg阴转的情况下，整合仍然可以存在。在感染早期，病毒基因组即可突破免疫防线，通过非同源末端连接等机制插入人体染色体，这种"早潜伏"特性使得慢性乙肝患者在疾病初期就埋下癌变隐患。整合后的病毒DNA片段常发生截短或重排，表达如HBx截短蛋白等异常产物，通过激活癌基因、抑制抑癌通路等方式持续驱动细胞恶性转化，这正是部分患者在病毒载量极低情况下仍发生肝癌的重要原因之一（图6）。

整合的S序列是HBsAg的来源之一，表达整合来源HBsAg的克隆性扩增肝细胞的数量随年龄增长而增加，但机体内HBsAb特异性T淋巴细胞的数量则随年龄增长而减少[14-16]。

图5. 不同HBV感染阶段中整合的变化

（引自讲者幻灯）

图6. HBV DNA整合是HBV-HCC发生的重要原因之一

（引自讲者幻灯）

多项研究表明[17-19]，抗病毒治疗可通过抑制病毒复制，减少HBV整合事件的数量。特别是长期抗病毒治疗，整合事件的数量显著下降。整体看抗病毒治疗使患者获益的分子机制主要包括：减少dslDNA的产生；缓解肝组织局部炎症反应，减轻氧化损伤，减少宿主双链DNA断裂，降低整合发生的概率；减少含有HBV整合的肝细胞的选择性扩增（图7）。

图7. 抗病毒治疗能抑制整合

（引自讲者幻灯）

当前针对HBV DNA整合的治疗策略各有侧重，既有临床验证的成熟方案（如抗病毒药物治疗），也有充满潜力的前沿技术，共同勾勒出乙肝治愈的可能路径。

NAs的作用主要为抑制HBV DNA聚合酶功能，减少病毒复制，进而减少新的HBV DNA整合。中国台湾学者的一项研究显示[20]，接受NAs治疗3年的患者，肝细胞内HBV整合序列数量平均下降67%，特别是转录活跃的HBV DNA数量显著下降，有效延缓了整合相关肝损伤的进展（图8）。不过，这类药物只能减少新整合，无法清除已经整合到宿主基因组中的病毒序列。

图8. 核苷类药物的治疗能抑制HBV DNA整合

（引自讲者幻灯）

IFN-α可通过减少pgRNA的合成减少新的整合，同时可增强宿主免疫反应，清除携带整合的克隆肝细胞。PEG IFNα不仅可以抑制病毒复制，其对患者还有免疫调节作用，能够通过激活HBV特异性CD8+ T细胞，甚至清除既存的携带整合DNA片段的克隆性扩增肝细胞[21]。2023年发表的一项研究证实[22]，在实现临床治愈的乙肝患者中，肝细胞内整合的HBV DNA数量显著低于未治愈患者，提示IFN-α可能通过增强免疫系统的识别-清除能力，降低整合克隆的存活概率（图9）。

图9. 功能性治愈对HBV DNA整合的影响

（引自讲者幻灯）

此外，还有一些正在研究中的能消除HBV DNA整合的消除策略[23-29]（表2）。比如，近年来备受关注的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9），通过设计特异性sgRNA，直接靶向切割已整合的HBV DNA序列。

表2. 研究中的能消除整合的治疗策略

（引自讲者幻灯）

HBV DNA整合在感染早期即可出现，并贯穿感染全程，是肝癌发生的重要因素之一。通过促进癌症相关基因表达、增加染色体不稳定性及表达截短型HBV蛋白等机制，促进肝癌发生发展。近年来，测序相关的先进的检测技术提升了检测HBV整合的能力，为临床研究提供了重要支持。

抗病毒治疗能够减少整合事件，早期抗病毒治疗具有重要意义。但目前的抗病毒药物尚难以完全清除整合DNA，cccDNA和HBV DNA整合在“临床治愈”后仍可存在，成为HBV再激活及HCC发生的重要风险因素。针对HBV整合的治疗策略正在不断探索，正在成为乙肝治愈和肝癌防治新的研究方向。

参考文献：

1.Brechot C et al.Nature(1980).

2.Jia Liu et al. Hepatic Medicine: Evidence and Research(2024).

3.Mingming Zhang, Han Chen, Huan Liu, Hong Tang et al. Biomark Res(2024)12:84.

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