有宝子问我小分子蛋白如何跑，本人一直在跑15KD, 12KD, 20kd的蛋白，分享一些自己的小经验给大家。 ✅1.聚丙烯酰胺凝胶的选择（图2）： ❗️第一：选择对的胶是关键的一步，不要让小分子蛋白对应的marker跑到胶的最下面。 若特别小的蛋白例如12KD，这时候选择10KD和15KD, 20KD分的很开的胶。 若跑出来的胶的最下面的两个marker挨的特别紧，例如：10KD和15KD挨的特别近，这时候不要孵育10～15kd分子量的蛋白，大概率不好看。 15以内的小分子尽可能选择15%或者13.5%的胶。 ❗️第二：选择浓缩胶长一些的胶去跑小分子（图3）。 （预制胶不在范围内）自己配胶的宝子，可以把浓缩胶配的长一点。 进入分离胶以后不要立马调电压，等marker更明显一些再调电压。 分离层调电压不要调太高，小分子低电压跑。 85v浓缩，让蛋白在浓缩胶里更聚集一些。 130v分离，非小分子蛋白我都150v。 ✅2.跑胶： ❗️第一：上样蛋白量比以往多一点。 日常跑胶20～30ug足够，跑小分子上30～40ug的蛋白，根据自己的目的蛋白调整。 尽可能使蛋白浓度高，上样体积小。（之前笔记提到过上样量对条带的影响） 用1.5mm的板跑小分子蛋白，条带成功率更大。 ❗️第二：跑小分子蛋白的时候loading带不用跑到胶的最下面（图4）。 跑到marker正常分离，目的条带跑出，即可转膜，不要跑到胶的最下面再转膜，越跑越容易翻车。 ✅3.转膜 小分子蛋白转膜最好用0.22的pvdf膜。 0.22的膜不用担心转过，小分子大分子可以一起转都没问题。 如果要用0.45的膜转小分子蛋白，记住一个原则：理论上1KD转1min，再比理论上多10min即可，转太久容易丢失蛋白信号。 例如：15kd的蛋白，可以85v恒压或350mA恒流转30min。 （封闭正常封闭即可，封闭完可以洗10min再敷一抗） ✅4.敷一抗： 保证抗体好用，增加孵育时间。我一般过夜孵育14h。 （评论区继续）