对于荧光定量 PCR 结果的判断，最直观就是看扩增曲线是否漂亮，即扩增曲线是否符合正常标准。如果是做染料法 qPCR，还需要检查熔解曲线是否符合标准。 扩增曲线是随着 PCR 反应的进行，扩增产物不断积累，荧光信号强度不断增加，仪器每经过一次循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，得到的扩增曲线图。 熔解曲线是指反应随温度升高，双链扩增产物逐渐解链，荧光信号逐渐减小的曲线。 ✅良好的扩增曲线和熔解曲线的标准主要有： 1）扩增曲线有明显的 4 个时期，基线期平滑无上扬，拐点清楚，指数期明显，曲线整体平滑。 2）复孔间扩增曲线的指数增长期重复性较好。 3）熔解曲线单峰。 ✅扩增曲线相关问题： 🎃无扩增曲线 可能的原因： 1. 没有打开荧光信号采集。检查程序设置，三步法扩增程序在 72℃ 延伸阶段采集信号，两步法扩增程序的信号采集设置在退火延伸步骤。 2. 引物降解。可通过 电泳检验引物的完整性。 3. 模板浓度低。建议增加模板投入量或重新制备较高浓度模板。 🎃扩增曲线不光滑 可能的原因： 1. 仪器长时间未校准，在检测中出现了波动，建议定期校准仪器； 2. RNA 模板不纯，建议增大模板稀释倍数或者重新制备较高纯度的 RNA 模板。 🎃扩增曲线平台期抖动 可能的原因：仪器与管材不匹配导致的信号采集产生波动。 🎃扩增曲线右下方下落呈倒扣状 可能的原因：模板浓度过高，仪器默认起峰位置仍为基线期，将起峰位置往基线下拉，所以扩增曲线变成了倒扣的 S 形。 ✅熔解曲线杂峰 🎃杂峰在主峰之前 可能的原因：杂峰在主峰之前，Tm 在 70～75℃ 范围内，一般是引物二聚体。引物二聚体是引物 3’ 端的部分碱基互补结合，在 Taq 酶的作用下，3’ 端延伸后得到的小分子量的双链 DNA 片段。可根据无模板阴性对照判断是否为引物二聚体。 👾解决方案： 建议通过提高模板浓度、提高退火温度、降低引物浓度来改善。 🎃杂峰在主峰之后 可能的原因：非特异性扩增，或体系中有气溶胶污染。 👾解决方案：建议先提高退火温度，可提高扩增特异性。如果提高退火温度对于特异性没有改善，建议更换特异性较高的引物。