制样的protocol和详细tips总结在图3图4～[喝奶茶R] 这里主要再想强调一下IgG的问题，因为很多宝都反应：IgG太浓太掩盖目的条带怎么办？那如何有效避免呢？总结了几点分享给大家～👌 ✅1、异源抗体的使用（可部分避免）； 举例：鼠抗做ip，兔抗做wb。 ✅2、无IgG二抗的使用（可部分避免）； 可采用去除轻重链的二抗孵育，而不是普通二抗。 ✅3、做外源性coip，可考虑使用纳米抗体； 偶联一抗和beads，且去除IgG，但只有标签系列，内源coip不可用。 ✅4、外源性coip，质粒可带标签（例如Flag)； 标签很容易ip下来，可增强丰度不被IgG掩盖。 ✅5、洗beads可多洗几次，5次打底可到6-8次； ‼️6、加一抗需要注意的点（重点）： ↗️抗体浓度：抗体原管浓度可能不一致，一般情况下都是IgG浓度高，目的蛋白浓度较低； ↗️蛋白丰度：细胞内IgG含量远高于目的蛋白。 ‼️🌿因此，加一抗时不要等体积添加，注意按质量添加，一般情况下，IgG一抗的使用量要比目的蛋白少很多倍，具体情况具体分析！ 7、使用好用的一抗去ip目的蛋白。 🌿Ps：做coip实验可以自己配相关试剂，之前也有分享过，若课题组不缺💰的话，优选还是用成品试剂，毕竟自己配各种试剂较为麻烦。 👉🏻成品试剂盒优点：裂解液效果更充分；裂解时间相对较短；一抗孵育后与beads结合时间较短；非特异性结合较少等。。。 ➡️最近测评了ACE的coip试剂盒，也可做ip，效果还不错～它是实验需要的试剂都包含在里面了，各种buffer和beads，直接参考说明书做即可，我优化了一下protocol，标记在图中了。 ➡️用此试剂盒做了一批实验，结果在图3； ➡️他们家coip试剂盒有两种，一种是proteinA/G的多聚物磁珠，一种是直连标签抗体的磁珠，都可以选择哦～直连抗体的beads的好处就是提前偶联了一抗到beads上，实验所需步骤也简便很多，且不用再单独孵育一抗～感觉效果还不错[派对R]