1.类器官收集 ①取出类器官培养板，镜下观察类器官大小，待类器官培养到直径100-200μm大小时，即可进行类器官石蜡包埋； ②使用移液枪吸去培养液，加入等体积的预冷基础培养基，使用润洗后的枪头（剪去尖端）轻轻划破或吹散基质胶和类器官的混合培养物，转移至1.5mL离心管中，轻柔吹打几次，冰上静置5min。 ③300g，4℃，离心3min后，可见培养基、基质胶、类器官沉淀从上至下分三层。如果基质胶去除不干净，可再次用基础培养基重悬类器官离心后弃上清直至基质胶去除干净。 2.类器官固定、清洗 ①PFA固定 1mL 4% PFA加入类器官沉淀悬液中，轻柔吹打使其混匀，后于冰上或4℃静置固定1h。固定结束后，300g4℃离心5min弃去上清。 ②类器官清洗 加入1mLPBS重悬类器官，300g4℃离心5min弃去上清，将类器官沉淀转移至 60-70°C 水浴或金属浴中预热待用。 3.琼脂糖包埋类器官 ①在微波炉中隔水加热至3%的琼脂糖彻底融化，操作时避免琼脂糖溶液沸腾，否则会导致液体损失及浓度改变。 ②加入30-50μl已完全溶解琼脂糖溶液，使用润洗后的枪头（剪去尖端）重悬类器官沉淀，冰上放置30min，待其凝固。 4.石蜡包埋、切片、脱蜡至水 5.免疫染色 ①高温抗原修复 ②封闭： 5%BSA封闭30min; ③孵育一抗：每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃ 孵育过夜； ④孵育二抗：第二天加荧光二抗： PBST浸洗爬片 3 次，每次 3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中 20-37℃ 孵育 1 h，PBS 浸洗爬片 3 次，每次 3 min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行 ⑤DAPI染核：滴加 DAPI 避光孵育 5 min，对标本进行染核，PBS 5 min×4 次洗去多余的 DAPI； 6.封片观察 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。