贞观二十三年（649年），唐太宗病逝于行宫翠微宫，临终前命长孙无忌与褚遂良辅政。同年六月，太子李治继位，是为唐高宗，封长孙无忌为太尉、同中书门下三品，兼任扬州都督。对于长孙无忌的进言，唐高宗每次都优先采纳。永徽二年(651)，长孙无忌主持编撰本朝历史。次年，长孙无忌由于旱灾上疏辞职，唐高宗多次亲手写出诏令敦促开导，不同意他辞职。同年，唐高宗命令长孙无忌审问房遗爱与高阳公主谋反之事。为免死罪，房遗爱效仿当年太子李承乾的卫士纥干承基告密太子谋反一事，自称与吴王李恪是同谋。先前，因阻拦唐太宗立吴王李恪为太子一事，长孙无忌与吴王关系恶化。而吴王李恪平素名望较高，为人心所向，长孙无忌颇为忌恨他，一直都想找借口诛灭李恪以断绝众望。房遗爱的口供便给了长孙无忌一个诛杀吴王的借口。永徽四年（653年），唐高宗诏令将房遗爱、薛万彻、柴令武处斩，李元景、李恪、高阳公主、巴陵公主也一并被赐自尽。同时，因素来与江夏王李道宗不合，长孙无忌借机打击，将其流放到广西象州。次年，唐高宗带着武昭仪亲自登门拜访长孙无忌，为以后提出废王立武做好了前期规划。永徽六年（655年），唐高宗决定废掉王皇后，改立武则天为皇后，并屡次征求长孙无忌的意见，但长孙无忌始终未同意废后之事。为此，唐高宗还曾暗中派遣使者赏赐长孙无忌金银宝器各一车、绫罗绵帛共十车，取悦于他。最终，唐高宗还是未听从长孙无忌等人的劝谏，强行立武则天为后。次年，长孙无忌和史官国子祭酒令狐德主编高祖武德、太宗贞观两个时代的历史共八十卷，上表进献给高宗。因主持编写有功，长孙无忌得到了二千段绢帛的赏赐，他的儿子长孙润则被封为金城县子。 武则天因长孙无忌在立后事情上不肯支持自己，对其怀恨在心。显庆四年（659年），武则天的亲信许敬宗诬陷长孙无忌图谋造反，唐高宗便命许敬宗与侍中辛茂将一同审查此案。而后，唐高宗在未亲自找长孙无忌本人查问谋反之事的情况下，只是听信许敬宗的诬陷不实之词，便撤去了长孙无忌的官职爵位，并将他流放黔州，让沿途州府发兵护送。与此同时，长孙无忌的儿子长孙冲等人也均被取消原有身份，流放到岭南。同年七月，唐高宗令李勣、许敬宗复审长孙无忌谋反案。许敬宗命其部下袁公瑜审讯长孙无忌，袁公瑜逼得长孙无忌自缢。长孙无忌死后，家产被抄没，近亲属都被流放岭南为奴婢。上元元年（674年），唐高宗追复长孙无忌官爵，为他平反，并将他葬于昭陵。
