在抗体偶联药物（ADC）的开发中，抗体决定靶向性，细胞毒性载荷决定杀伤能力，而位于二者之间的连接子，则控制药物在何时、何地以及以何种形式释放。随着越来越多ADC进入临床，人们逐渐发现，连接子并不是被动的化学桥梁，其蛋白酶选择性、疏水性以及组织稳定性，可能直接决定ADC的治疗窗口。

近日，辉瑞研究团队在《Bioconjugate Chemistry》报道了一 种含D-氨基酸的三肽连接子DLeu-Ala-Glu 。研究显示， 该连接子在保留MMAE类ADC抗肿瘤活性的同时，可显著降低大鼠和食蟹猴中的骨髓毒性，为经典Val-Cit连接子的优化提供了新的方向。

Val-Cit的成功背后，是难以忽视的骨髓毒性

Vedotin类ADC通常采用单甲基澳瑞他汀E（MMAE）作为载荷，并通过可切割的Val-Cit二肽连接子与抗体偶联。ADC进入肿瘤细胞后，在溶酶体蛋白酶作用下释放MMAE，从而杀伤靶细胞，并通过旁观者效应影响邻近肿瘤细胞。

然而，Val-Cit并非只会在肿瘤细胞内被切割。 骨髓微环境中的中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3同样可能在细胞外切割该连接子 ，导致MMAE提前释放，并进一步损伤造血祖细胞，引发中性粒细胞减少和骨髓抑制。

因此，研究人员希望寻找一种 “肿瘤中可切割、骨髓中更稳定” 的新型连接子，而不是简单追求整体稳定性的提高。

从1728种三肽中筛选肿瘤选择性连接子

研究团队采用SPOT合成技术构建了包含1728种序列的三肽荧光底物库。每种底物均包含可变三肽、自降解型PAB间隔臂和荧光团，当三肽被蛋白酶切割后，荧光信号随之增强。

与围绕单一蛋白酶进行筛选不同，研究人员直接比较了四种癌细胞匀浆与人骨髓匀浆中的整体水解能力，从而筛选在肿瘤环境中切割效率较高、但在骨髓环境中相对稳定的序列。最终，5种候选三肽被整合进MMAE药物连接子中，并进一步进行体外活性和动物毒性评价。

多种候选ADC在胰腺癌细胞中表现出与vedotin相近的细胞毒性，说明替换Val-Cit并未必影响MMAE的有效释放。但在动物实验中，DLeu-Ala-Glu逐渐显示出明显优势 。

DLeu-Ala-Glu显著降低骨髓损伤

研究人员将不同三肽-MMAE连接子偶联至非靶向hIgG1抗体，并以10 mg/kg单次注射至大鼠体内。Vedotin组出现严重的中性粒细胞和网织红细胞下降，骨髓中的红系和髓系造血细胞明显减少；相比之下，DLeu-Ala-Glu组仅出现轻微血液学变化，骨髓组织结构也得到较好保留。

与此同时，DLeu-Ala-Glu-MMAE ADC产生的游离MMAE暴露量约为vedotin组的一半，其单次最大耐受剂量达到40 mg/kg，而vedotin ADC约为15 mg/kg，耐受剂量提高至约2.5倍。

这一安全性优势也延续至食蟹猴。在相同剂量下，vedotin组出现更明显的白细胞和中性粒细胞下降，并伴随骨髓造血细胞减少；DLeu-Ala-Glu组的骨髓损伤程度则明显减轻。

更重要的是， 在多个Trop2或ALPP阳性异种移植模型中，DLeu-Ala-Glu ADC的抗肿瘤活性与vedotin ADC总体相当，说明治疗窗口的扩大并不是通过牺牲疗效实现的 。

一个D-亮氨酸，改变了蛋白酶识别

机制研究显示，Val-Cit在中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3作用下会发生明显切割，而DLeu-Ala-Glu三肽基本保持完整。当D-亮氨酸被替换为天然构型的L-亮氨酸后，LLeu-Ala-Glu又重新变得容易被切割，说明D -氨基酸构型能够干扰骨髓蛋白酶对连接子的识别 。

在CD34 ⁺ 造血细胞实验中，经粒细胞条件培养基处理后的vedotin ADC产生明显细胞毒性，而DLeu-Ala-Glu ADC没有出现类似效应，进一步证明其能够抵抗中性粒细胞来源蛋白酶的细胞外切割。

亲水性同样是降低毒性的关键

DLeu-Ala-Glu中的谷氨酸使连接子具有更高亲水性。研究人员发现，连接子的疏水性越强，ADC在血浆中的非特异性结合越高，骨髓毒性也越明显。因此，DLeu-Ala-Glu的优势来自两个方面： D-氨基酸提高了蛋白水解稳定性，而较高亲水性则减少了ADC的非特异性结合和正常组织摄取 。

进一步的多次给药实验表明， 疏水性可能更容易驱动早期急性毒性，而连接子的蛋白酶稳定性则对降低延迟性和累积性骨髓损伤更为关键 。

总结

这项研究并不是简单找到一个“更稳定”的三肽，而是通过同时优化蛋白酶选择性和理化性质，使ADC在肿瘤中保留药物释放能力，在骨髓中减少提前断裂和非特异性摄取。

DLeu-Ala-Glu尚不能解决靶抗原在正常组织表达所引起的在靶、脱肿瘤毒性，其临床价值也仍需进一步验证。但这项工作提示，下一代ADC连接子的设计目标，已经不再只是“能够释放载荷”，而是让载荷尽可能在正确的组织、正确的时间被释放。

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