固相合成法是主流技术，核心是将核酸链一端固定在可控孔玻璃（CPG）或聚苯乙烯树脂等固体载体上，通过脱保护、偶联、氧化 / 硫化、封端的循环反应逐步延伸核酸链。该方法可自动化控制，合成效率高，能精准制备 10-100nt 的短至中长链适配体，还可灵活引入荧光标记、磷酸化等修饰基团。其优势在于序列可控性强、无需复杂分离，适合大规模工业化生产，是科研与产业化的主要选择。
（二）酶促合成法：温和型定制化制备酶促合成法利用 DNA 聚合酶、RNA 聚合酶等工具酶，在接近生理条件（37℃左右、中性 pH）下，通过碱基互补配对催化核苷酸聚合。该方法反应温和，能最大程度保留适配体天然构象与活性，尤其适用于长链适配体（>100nt）或复杂结构适配体的制备。但存在合成效率低、难以灵活修饰、规模化难度大等局限，主要用于特定序列的定制化研发。
二、合成过程质控：全环节精准把控（一）源头原料质控原料品质直接决定合成起点质量。固相合成需选用纯度≥99% 的亚磷酰胺类核苷酸单体，经 NMR 或 MS 验证结构；辅助试剂需为 HPLC 级，脱水后使用。酶促合成则需高活性、高特异性酶制剂与高纯度核苷酸底物。所有原料需严格避光、防潮、低温储存，防止活性损伤。
（二）反应条件优化固相合成需调节脱保护试剂浓度（3%-5% TCA）、反应时间（60-90 秒）及偶联反应参数，确保反应高效、减少副反应。酶促合成需优化温度（37-42℃）、pH（7.0-8.0）、底物比例与酶用量，构建最优催化环境。通过针对性参数调整，可提升连接效率、降低错配率。
（三）关键步骤精细化固相合成需精准把控脱保护与偶联步骤，通过紫外监测确保保护基完全脱除，反应后充分洗涤去除杂质。酶促合成需控制反应时间，避免过度聚合，反应终止后及时纯化，防止酶持续催化引发副反应。固相合成的氧化 / 硫化步骤需保证体系均匀，保障适配体稳定性。
三、合成后纯化：杂质高效去除合成粗产物含未反应原料、错配链等杂质，需通过纯化提升质量。核心纯化技术为液相色谱法：反相 HPLC 适用于短至中长链适配体，可去除盐类与短片段杂质，纯度达 95% 以上；离子交换 HPLC 适合长链或修饰型适配体，精准去除错配链。
对纯度要求≥98% 的适配体，可采用 “液相色谱粗纯化 + 凝胶电泳精制” 的联合策略，利用凝胶电泳高分辨率分离微量杂质。纯化后需通过 HPLC、质谱、紫外分光光度法验证纯度，确保产物合格。
四、总结核酸适配体的高质量制备依赖 “合成方法合理选择 + 全流程质控 + 高效纯化” 的系统性方案。固相合成法满足规模化需求，酶促合成法适配定制化研发，二者互补覆盖不同应用场景。
