本文通过ChatGLM/GPT进行辅助对近期Bio-protocol 期刊发表的方案进行解读和概括，若感兴趣请点击“阅读原文”查看详细的实验流程及试材。如果解读中有任何错误或遗漏，敬请指正。

2024年7月5日，Bio-protocol 期刊在线发表了法国波尔多大学（CNRS-University of Bordeaux）Valérie Wattelet-Boyer团队题为“Versatile Cloning Strategy for Efficient Multigene Editing in Arabidopsis”的方法文章。

https://doi.org/10.21769/BioProtoc.5029关键词：植物基因组编辑 CRISPR-Cas9 拟南芥 sgRNA多重化 Gateway®克隆 Golden Gate克隆

CRISPR-Cas9(CRISPR-Cas9)是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA，受此机制启发，科学家们研发了CRISPR-Cas9基因编辑技术，这是一种对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，其原理是由一个向导RNA分子引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的任一目标位点进行切割。

CRISPR-Cas9技术是一种革命性的基因组编辑工具，已广泛应用于植物基因工程中。该技术依赖特定的向导RNA（sgRNA）来指导Cas9核酸酶精确剪切目标DNA，从而实现基因的敲除或修饰。近年来，通过使用二元载体系统，研究者们已开发出多种Cas9和sgRNA的表达策略，优化了植物的转化效率和编辑精确度。特别是多sgRNA的策略有效应对了基因冗余和编辑效率低下的问题，减少了多次回交的需求。此外，选择合适的启动子以控制Cas9的表达，如使用特异性或可诱导的启动子，可以进一步提高编辑的特异性和减少镶嵌变异。结合MultiSite Gateway®和Golden Gate技术的克隆系统为植物基因组的高效编辑提供了更多灵活性和便利性，使得研究者能够针对复杂的遗传背景进行精确的基因操作，推动了植物生物技术的发展。

通过使用多sgRNA的策略，可以同时针对多个基因进行编辑，提高了操作的效率和适用性。

采用特定于卵细胞的启动子EC1.2及其增强子EC1.1来控制Cas9的表达，有效减少了镶嵌变异，增强了基因编辑的均一性。

结合了Gateway®和Golden Gate技术的克隆系统，允许灵活地组合不同的编辑元素，如sgRNA和Cas9表达序列，方便用户根据需要定制构建。

作物遗传改良利用本文中的方法可以精确编辑作物基因组，以增强作物的抗病性、抗逆性或提高营养价值。功能基因组学研究‍通过针对特定基因的编辑，可以探索这些基因在植物生长发育和代谢中的具体功能，为基因功能的深入研究提供工具。

植物病理学研究通过编辑植物基因组中的病原体相关基因，可以研究这些基因与植物病理之间的关系，为病害防治提供新策略。

这个方法的可重复性已经被本文作者法国波尔多大学（CNRS-University of Bordeaux）Valérie Wattelet-Boyer团队验证过，相关实验数据与结果请见原文的“Validation of protocol”章节。

温馨提示：积极引用本文不仅是对作者创新技术和科研共享的最佳肯定，也是确保实验可复现性的重要方式。

Li, Z. P., Huard, J., Bayer, E. and Wattelet-Boyer, V. (2024). Versatile Cloning Strategy for Efficient Multigene Editing in Arabidopsis. Bio-protocol 14(13): e5029. DOI: 10.21769/BioProtoc.5029.