引言
冠状病毒（如SARS-CoV-2，SARS-CoV，MHV，MERS-CoV等）属于正链 RNA 病毒家族，在复制过程中会利用自身的非结构蛋白重构宿主细胞内膜，形成双层膜囊泡（Double membrane vesicle, DMV）结构，为病毒基因组 RNA的合成和修饰提供一个中心枢纽，保护病毒 RNA逃避宿主细胞免疫系统的监控。
尽管DMV在冠状病毒复制中的重要功能已得到证实，但新合成的病毒 RNA 分子如何转运以进行蛋白合成和病毒粒子组装的机制仍不清楚。利用原位低温电子断层扫描技术（In situ cryo-electron tomography, cryo-ET）进行的研究发现，在MHV和SARS-CoV-2感染细胞中的DMV上存在孔复合体。这种孔复合体的分子量约为 3 MDa，是具有 6 倍对称的双跨膜结构。冠状病毒三分之二以上（约 20 kb）的基因组RNA编码 16 个非结构蛋白（non-structural protein, nsp），与宿主蛋白一起构成冠状病毒复制-转录复合体（replication-transcription complex，RTC）。其中，非结构蛋白nsp3和nsp4是形成DMV孔复合体所需的最小病毒成分。然而，利用原位方法解析的这些孔复合体的分辨率有限（约 20 Å），DMV 孔复合体形成的分子机制以及整个孔复合体的结构细节仍未被揭示。
2024年8月14日，香港大学李嘉诚医学院倪涛课题组联合袁硕峰课题组在Nature在线发表了题为 “Molecular Architecture of Coronavirus Double Membrane Vesicle Pore Complex”的研究成果。该研究团队利用分离纯化的SARS-CoV-2 DMV，通过Cryo-ET技术和断层扫描平均法（subtomogram averaging, STA），首次解析了4.2 Å分辨率的DMV孔复合体结构，初步揭示了病毒利用DMV孔复合物进行RNA转运的分子机制，为开发针对冠状病毒DMV 孔复合体形成和RNA 转运的抗病毒药物提供了重要的指导信息。
研究团队在体外利用HEK293F表达系统，经过一系列样品制备条件的摸索，成功表达并纯化分离得到包含非结构蛋白nsp3和nsp4的双层膜囊泡DMV。通过应用serialEM PACE-tomo脚本采集了大量的冷冻电子断层扫描数据，通过子断层平均方法，最终成功解析了DMV nsp3-4孔复合体的三维结构。该结构显示，除了nsp4的C端结构域呈现3倍对称性，完整的孔复合物呈6倍对称性并由12个nsp3和12个nsp4构成，体现出DMV孔复合体独特的化学计量比和拓扑结构 (图1)。
图1 DMV nsp3-4孔复合体的三维结构对DMV孔复合体的结构细节进行分析发现，nsp3和nsp4的跨膜域相互交错，在双膜连接处促发膜局部出现高曲率进而诱导孔的产生。nsp3 定位于DMV外膜（胞质侧），nsp4 则位于双层膜交界处和内膜。两种非结构蛋白nsp3和nsp4的跨膜区以及双层膜夹层内侧的ecto结构域构成整个孔复合体的结构基础。进一步的结构分析显示，一系列疏水和亲水的氨基酸残基构成nsp3和nsp4 ecto结构域的相互作用界面。例如，D1478、Y1483、L1486和Q1490的突变可以破坏nsp3与nsp4的相互作用进而影响DMV的形成（图2）。
更重要的是，研究发现，DMV孔复合体的中心具有含三个收缩位点的带正电荷通道，可以介导RNA 和代谢产物的跨膜运输。在孔道中对称分布的精氨酸残基在不同的β冠状病毒中高度保守，对于病毒的复制至关重要（图3）。这个孔道直径大约1.7纳米，足够介导单链RNA穿过。
图3 DMV孔复合体结构示意图（Credit: Nature）综上，这项工作利用分离的SARS-CoV-2 DMV为在近原子分辨率层面研究病毒复制机制提供了宝贵的体外系统，DMV孔复合体结构的解析为人们理解冠状病毒的复制提供了新的视角，也为剖析由 DMV 孔复合体和 RNA 复制/转录机器组成的完整复制/转录复合体的结构和功能奠定了重要基础。参考文献
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07817-y责编|探索君
排版|探索君
文章来源|“BioArt”
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