近日，澳门大学徐昌活博士和香港科技大学唐本忠院士团队造出一款名为 OTBP-G 的新型聚集体荧光探针。

图 | 徐昌活（来源：徐昌活）

其具有超高的信噪比，在 1040nm 双光子激发之下，能在体内外针对目标肿瘤标志物实现高灵敏度检测。

在细胞成像和组织成像中，团队利用 OTBP-G 成功实现了谷氨酸转肽酶的高灵敏度检测，其中荧光开关比分别大于 900 和 400。

同时，OTBP-G 也能对针对老鼠原位乳腺癌和肺部转移模型实现灵敏成像，这说明其具备用于肿瘤早期诊断的潜力。

长远来看，本次成果有望用于外科手术中癌症病人肿瘤组织的精准切除。

具体来说：在光源的激发下，外科医生可以向肿瘤组织喷洒荧光探针溶液。这时，存在荧光信号的区域判别为肿瘤组织，那么医生就可以在高对比度荧光信号的引导之下精准地切除肿瘤。

这样一来，既能避免正常组织被过多地切除，又能帮助医生甄别和切除残留在正常组织周围的微小病灶，从而避免可能引发的肿瘤复发和肿瘤转移。

（来源：ACS Nano）

日前，相关论文以《用于 γ-谷氨酰转肽酶和癌症检测的近红外二区可激发的 1000 倍开关比吡啶盐探针》（A Near-Infrared-II Excitable Pyridinium Probe with 1000-Fold ON/OFF Ratio for γ-Glutamyltranspeptidase and Cancer Detection）为题发在 ACS Nano（IF 15.8）。

沈翰辰博士和杜立冬是共同第一作者，澳门大学的徐昌活博士和刘子铭教授以及香港科技大学唐本忠院士担任共同通讯作者 [1]。

图 | 相关论文（来源：ACS Nano）

如何获得完美的聚集体荧光暗态？

据介绍，相比传统的正电子发射断层扫描成像和磁共振成像，近红外荧光成像在肿瘤精准诊断中的成本、安全性、时间分辨率等方面具有显著优势。

在提高肿瘤分子影像的灵敏性和特异性上，近红外分子荧光探针技术扮演着关键角色。

近红外分子探针通常具有较大的共轭结构，因此在水相生物环境中，往往倾向于形成介观尺度的聚集体，这让其光学性质与单个自由分子存在一定区别。

在以往的分子荧光探针研究中，人们在生物应用的过程中，并未过多关注介观聚集体的存在。

但是，探针聚集体的形成已经大大改变分子态原有的光学性质，进而能够影响荧光探针对于特定肿瘤标志物的识别和响应。

因此，在近红外荧光探针的设计过程中，对于聚集体的考量就显得尤为关键。

此时，甚至可以利用聚集态下特殊的光学性质，来放大荧光检测的信噪比，从而达到“化腐朽为神奇”的效果。

在生物水相环境之中，要想实现优越的探针点亮开关比，则会对所使用的荧光母核提出苛刻要求。

目前，大多数荧光母核在聚集态之下，会发生荧光淬灭的现象，即由于聚集导致发光淬灭。

而在聚集态之下，聚集诱导发光染料的荧光性能会被显著提升。因此，对于水相检测环境中荧光母核来说，聚集诱导发光染料是一种绝佳选择。

这样一来，当探针被激活之后，就可以生成具有强荧光发射的聚集诱导发光聚集体。

其中，在荧光传感领域，聚集诱导发光吡啶盐染料已经获得广泛应用。

比如，人们使用可触发的分子开关，来制备吡啶盐探针。再通过化学脱笼的策略，释放聚集诱导发光吡啶荧光母核，借此实现特异的底物检测。

然而，聚集诱导发光吡啶盐探针目前存在的问题是：由于分子骨架继承了吡啶荧光母核的聚集诱导发光特性，因此成盐之后的聚集体探针仍然具有很强的荧光背景。

在细胞或组织的成像过程中，正电性的吡啶盐探针还能和负电性的生物大分子发生非特异性的静电相互作用，这会进一步地增加荧光背景，导致更难实现肿瘤标志物的灵敏检测。

在这种情况之下，如何通过吡啶盐探针的结构设计来获得完美的聚集体荧光暗态，是一个亟待解决的技术难题。

（来源：ACS Nano）

实现 1000 倍的点亮开关比

据介绍，具有聚集诱导发光效应的有机荧光分子，在溶液态之下能够发生活跃的分子运动，这会导致有机荧光分子出现发光微弱甚至不会发光的情况。

而在聚集之后，由于分子运动受限，有机荧光分子则能发出强烈的荧光。

基于对于这种发光机制的理解，徐昌活与沈翰辰决定针对具有强荧光背景的聚集诱导发光吡啶盐探针进行分子改造。

他们发现：通过增加探针的水溶性，就能利用聚集诱导发光的性质，来降低探针未被激活时的荧光背景。

而在探针激活之后，则能形成疏水的聚集诱导发光聚集体，从而实现对于目标底物的点亮检测。

研究中，他们首先以下图所示的 ODBP 为荧光母核，通过引入可化学脱笼的谷氨酸基团和甲氧基，来制备水溶性的荧光探针 ODBP-G。

图 | 探针的分子结构（来源：资料图）

尽管该团队在实验中验证了上述探针的水溶性，但是探针的实际体外点亮效果却没有达到预期。

具体来说：相比于荧光母核，这款探针仅仅实现了 60 倍的点亮开关比，在细胞水平谷氨酸转肽酶的检测中只能显现出微弱的荧光发射。

通过一番调研之后，他们发现 ODBP 由于具有较好的亲水性，因此在水相中无法形成堆积紧密的聚集体，自然也就无法实现分子运动受限效应的最大化。

为了进一步提高聚集诱导发光荧光母核的疏水性，同时冒着可能增加荧光探针背景的风险，他们还是决定在 ODBP 分子骨架中引入一个额外的苯环，借此合成了候选荧光母核 OTBP。

令人惊奇的是，课题组发现 OTBP 在水相之中，极易形成高结晶度的聚集体，并且具有更强的分子运动受限效应和近红外荧光亮度。

而另外一个惊喜是：与之相应的吡啶盐探针 OTBP-G，尽管由于疏水性更强导致其水溶性降低，但是并未出现荧光背景增强的情况。

时间分辨荧光光谱和瞬态吸收研究表明，当增加苯环之后反而能够带来如下效果：即促进 OTBP-G 中扭转的分子内电荷发生转移从而生成荧光暗态，同时还能增加探针聚集体的三线态分布。

这种协同效应能够实现完美的荧光暗态，进而能够实现 1000 倍的点亮开关比，这让 OTBP-G 探针的性能得以超越此前报道的近红外荧光探针。

5 分钟内荧光就能被点亮

另据悉，通过化学合成的方式得到荧光探针之后，他们将探针与目标检测底物谷氨酸转肽酶进行共同孵育。

但是，早期他们并未观察到明显的荧光点亮过程。于是，课题组开始反思探针的疏水性，是否真的如预想般影响了对于谷氨酸转肽酶的响应。

万般无奈之下，他们直接在细胞水平尝试探针的点亮实验，万万想不到探针在细胞水平表现出令人称奇的响应速度，在 5 分钟内荧光就能被点亮，借此指明谷氨酸转肽酶的存在。

而在老鼠耳部血管双光子成像中，他们发现探针能在 30 秒之内，被血液中的谷氨酸转肽酶点亮，进而发射出增强的近红外荧光。

以上表明：探针的疏水性并不会影响其对于谷氨酸转肽酶的识别和响应，只是因为处于生物环境中的谷氨酸转肽酶表现出了更高的酶催化活性。

后来，他们多次尝试在非生物环境中，模拟生物环境的要素条件，希望能够提高酶的催化性能，但却始终未能实现快速的探针响应速度。

因此，他们猜测：处于生物环境中其他辅酶因子、酶蛋白多级空间结构、以及酶活性中心，能够高效地调节自身的催化活性速率。

至于这些因子将如何影响酶的催化速率，将是团队的后续研究方向之一。

与此同时，他们打算将此次提出的设计策略，用于近红外二区（1000–1700nm）荧光探针的制备，以提高近红外二区探针检测的信噪比。

此外，他们还将深挖探针的临床应用。目前，本次荧光探针已经在动物模型上达到了预期效果。

下一步，他们希望透过与医院的合作，探索这一系列探针能否用于临床病人离体组织样本的分析。

更重要的是，本次探针的设计策略具有广泛的适用性，比如通过化学合成手段改变分子触发开关，其将能够用于不同生物标志物检测的荧光探针。

最后，在这款单锁型探针的基础上，他们正在发展以聚集诱导发光吡啶盐为染料骨架的双锁型荧光探针。

希望能够进一步降低生物环境中其他成分对肿瘤诊断的潜在干扰，从而最大限度地提高探针检测的特异性。

参考资料：

1.ACS Nano 2024, 18, 31, 20268–20282.

2.J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 7, 4851–4863.

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