引言

在与癌症漫长的博弈史中，我们一度认为已经窥见了对手的底牌。我们曾以为，癌症的基因组混乱只是一场无序的随机突变，或者是染色体线性的扩增与缺失。然而，近年来，一种被称为染色体外DNA（Extrachromosomal DNA, ecDNA）的遗传物质，像幽灵一样浮出水面，彻底颠覆了我们对肿瘤进化的认知。

这些游离于染色体之外的环状DNA，不仅是癌基因（Oncogene）疯狂扩增的载体，更是一个移动的“突变工厂”。它们不受孟德尔遗传定律的束缚，在细胞分裂中不均等地分配，造就了肿瘤极高的异质性。但如果我们仅仅把ecDNA看作是癌基因拷贝数的简单“放大器”，那我们可能大大低估了它的险恶。

1月7日，《Cell》的研究报道“EcDNA-borne structural variants drive oncogenic fusion transcript amplification”，为我们揭开了ecDNA更深层的秘密。ecDNA不仅仅是基因的搬运工，它还是基因组结构变异（Structural Variants, SVs）的主要平台，它通过制造特定的基因融合（Gene Fusions），赋予了癌基因前所未有的稳定性，从而驱动肿瘤的恶性进展。

在深入分子机制之前，我们先来看看癌症基因组的宏观图景。基因融合，即两个原本独立的基因片段异常地连接在一起，是许多癌症的标志性特征。在正常组织中，这种现象极为罕见，但在肿瘤中，高负荷的结构变异往往会导致启动子劫持或融合转录本的形成，从而破坏基因调控。

长久以来，研究人员一直怀疑ecDNA与基因融合之间存在某种关联，因为在ecDNA上经常能观察到截断的基因。然而，ecDNA究竟在多大程度上驱动了基因融合？这种驱动作用是否具有普遍性？

为了回答这个问题，研究人员整合了来自癌症基因组图谱（TCGA）和癌细胞系百科全书（CCLE）的庞大数据库，涵盖了1,825个肿瘤样本和83种癌症类型。他们利用全基因组测序（WGS）和RNA测序（RNA-seq）数据，系统地分析了扩增子类型与基因融合之间的关系。

数据呈现出的趋势令人震惊：

在所有分析的癌症样本中，携带ecDNA的样本虽然只占一部分，但ecDNA上发生癌基因融合的频率却是所有拷贝数变异类型中最高的。具体而言，在ecDNA阳性的癌症中，超过一半（55.1%，即479个样本中的264个）携带了源自ecDNA的RNA融合。

更关键的证据来自于结构变异（SV）与RNA融合断点（RNA fusion burden）的空间相关性分析。研究人员在全基因组范围内划分了100 kb的窗口，发现结构变异的峰值与RNA融合的断点高度重合。在ecDNA上，这两者的相关系数高达0.7，而在其他类型的局灶性扩增或非局灶性扩增中，这一相关系数分别仅为0.56和0.08。这意味着，ecDNA上的基因融合绝非偶然的副产物，而是由其独特的环状结构和高频的断裂-重连机制直接驱动的。

进一步的分析显示，ecDNA上的基因融合表现出极高的转录活性。在全基因组范围内，ecDNA不仅是结构变异支持的基因融合（SVGF）发生率最高的区域，而且其产生的融合转录本表达水平也远超非ecDNA来源的融合。这种高表达不仅仅是因为基因拷贝数的增加。研究人员发现，ecDNA更容易发生能够促进肿瘤生长的“驱动突变”，从而在肿瘤进化中被保留下来。

在筛选了海量数据后，几个熟悉的名字跃入眼帘：EGFR、MYC、PVT1、MDM2和ERBB2。这些都是大名鼎鼎的癌基因，而在ecDNA阳性的癌症中，它们恰恰是融合发生频率最高的位点。特别是位于8q24染色体区域的MYC和PVT1，成为了研究人员关注的焦点。

在ecDNA引发的这场基因组风暴中，长链非编码RNA（lncRNA）基因PVT1扮演了核心角色。PVT1基因位于人类8号染色体上，紧邻著名的癌基因MYC下游约55 kb处。在正常组织中，PVT1的表达量很低，但在多种癌症中，它往往与MYC发生共扩增，并与不良预后密切相关。

研究人员发现，PVT1是ecDNA阳性癌症中最常见的融合热点。数据显示，PVT1融合在ecDNA来源的样本中的富集程度是主要在染色体上扩增的样本的4.4倍。更令人惊讶的是，当PVT1在ecDNA上扩增时，它展现出了极高的“社交能力”——它能与多种不同的伴侣基因发生融合，产生了惊人的转录本多样性。在ecDNA阳性样本中，72.3%的PVT1融合转录本直接源自ecDNA。

这种融合具有明显的组织特异性。例如，在肺癌中，PVT1和MYC的融合最为显著；而在乳腺癌和上消化道癌症中，ERBB2则是主角；中枢神经系统肿瘤中是EGFR，软组织肉瘤中则是MDM2。这种特异性暗示了ecDNA驱动的融合并非乱点鸳鸯谱，而是经过了严酷的自然选择，留下了最能适应特定组织环境的组合。

但是，为什么是PVT1？为什么这个非编码RNA会成为融合的中心？

通过长读长测序技术（Long-read sequencing），研究人员精确地绘制了这些融合转录本的结构。他们发现了一个惊人的规律：绝大多数（98.5%）的PVT1融合转录本都保留了PVT1的5'端，特别是其第1外显子（exon 1）。这一现象在多种癌细胞系中得到了验证。

具体来说，PVT1的第1外显子充当了一个“通用接头”，它可以与下游的各种基因片段连接。最典型的例子就是PVT1-MYC融合。在这种融合中，PVT1的启动子和第1外显子取代了MYC原本的启动子和第1外显子，与MYC的第2、3外显子（即包含编码区的序列）连接在一起。

这就引出了一个关键的生物学问题：这种“移花接木”究竟给癌细胞带来了什么好处？是PVT1强力的启动子增强了转录，还是融合后的RNA本身发生了某种质变？

为了解开这个谜题，研究人员利用了一对极具研究价值的同基因细胞系模型：COLO320DM和COLO320HSR。这两个细胞系源自同一患者，遗传背景极其相似，但MYC扩增的形式截然不同。COLO320DM细胞携带大量的ecDNA，而COLO320HSR细胞中的MYC扩增则位于染色体的均质染色区（HSR）。

在COLO320DM（ecDNA阳性）细胞中，研究人员检测到了高丰度的PVT1-MYC融合转录本，而在COLO320HSR细胞中，这种融合几乎不存在。有趣的是，尽管两个细胞系中MYC基因的拷贝数都在增加，但在校正了拷贝数差异后，COLO320DM中稳态PVT1-MYCmRNA的水平竟然比COLO320HSR中的经典MYCmRNA高出2到3倍。

这意味着，除了基因拷贝数的增加，还有某种机制在转录后水平上提高了mRNA的丰度。答案隐藏在RNA的稳定性中。

通常情况下，MYCmRNA是一个极其不稳定的分子，它的半衰期很短，这是一种精密调控机制，防止细胞生长失控。然而，当研究人员使用放线菌素D（Actinomycin D）抑制转录，并测量RNA的衰减速率时，惊人的差异出现了：PVT1-MYC融合转录本的衰减速率显著慢于经典的MYCmRNA。换句话说，PVT1第1外显子的加入，像给MYC穿上了一件“防弹衣”，使其在细胞内的存活时间大大延长。

为了验证这一点，研究人员构建了一系列巧妙的报告基因系统。他们将PVT1第1外显子或MYC第1外显子分别与荧光蛋白报告基因融合，置于相同的启动子控制下。结果显示，只要带有PVT1第1外显子，报告RNA的稳定性就显著提高。这有力地证明，这种稳定性获益并非来自启动子的差异，而是源于PVT1第1外显子序列本身。

更深入的机制探索指向了细胞内的一项质量监控机制——翻译偶联的mRNA衰减（Translation-coupled decay）。正常的MYCmRNA在翻译过程中会受到严格的监控，一旦翻译受阻或出现特定信号，就会被快速降解。然而，PVT1-MYC融合转录本似乎找到了逃避这一监控的“后门”。

当研究人员使用放线菌素D（转录抑制剂）和环己酰亚胺（CHX，一种翻译抑制剂）联合处理细胞时，经典的MYCmRNA在翻译被抑制后变得更加稳定（因为它原本依赖于翻译过程进行降解）。相比之下，PVT1-MYCmRNA对翻译抑制剂的反应却截然不同，它本身就已经非常稳定，不再依赖于这种翻译偶联的降解途径。这表明，PVT1第1外显子的存在，改变了RNA原本的代谢命运，使其逃脱了细胞的“清理程序”。

既然确定了PVT1第1外显子是稳定性的来源，那么它是如何做到的？这一定涉及到了特定的RNA结合蛋白（RBPs）。

为了捕捉与这段RNA结合的蛋白质，研究人员使用了一种名为ChIRP-MS（染色质分离纯化-质谱联用）的高精尖技术。他们设计了特异性的探针，分别在COLO320DM和COLO320HSR细胞中“钓”取与MYC转录本结合的蛋白质复合物。

通过对比两组质谱数据，研究人员筛选出了69种在PVT1-MYC融合转录本上显著富集的蛋白质。在这些蛋白质中，一个名为SRSF1的剪接因子引起了极大的关注。SRSF1不仅参与RNA剪接，还已知在mRNA稳定性调节和无义介导的衰减（NMD）中发挥作用。

随后的RNA免疫沉淀（RNA-IP）实验证实了这一点：SRSF1在内源性PVT1-MYCmRNA上的结合量显著高于经典MYCmRNA。

接下来的问题是：SRSF1结合在哪里？它是如何发挥作用的？

借助AlphaFold3这一革命性的蛋白质结构预测工具，研究人员构建了SRSF1与PVT1第1外显子RNA的三维复合物模型。预测结果显示，SRSF1的两个RNA识别基序（RRM）能够紧密地结合在PVT1第1外显子的5'端，特别是识别一个特定的序列基序“GAGGA”。

为了确凿地证明这种结合的功能性，研究人员进行了精细的突变实验。他们发现，如果删除了PVT1第1外显子5'端的75个核苷酸，或者将“GAGGA”基序突变为“UUUAA”，SRSF1的结合能力就会大幅下降，随之而来的是RNA稳定性的丧失。突变后的融合转录本重新变得不稳定，并且恢复了对翻译抑制剂的敏感性，这意味着它们失去了逃避降解机制的特权。

这一系列严密的实验逻辑链条，从发现现象到锁定蛋白，再到解析结构和功能验证，揭示了ecDNA驱动肿瘤进展的一个全新维度：它通过结构变异制造出包含PVT1第1外显子的融合基因，招募SRSF1蛋白，从而赋予癌基因转录本超乎寻常的稳定性。

如果仅仅是RNA稳定了，对癌细胞真的有那么重要吗？答案是肯定的，而且这种影响是决定性的。

MYC是一个转录因子，它控制着细胞生长、增殖和代谢的无数下游基因。但MYC也是一把双刃剑，过高的MYC活性会引发细胞凋亡或衰老。因此，癌细胞需要一种微妙的平衡，既要高水平的MYC来驱动增殖，又要避免过度激活导致的自杀。

ecDNA上的PVT1-MYC融合似乎完美地解决了这个问题。研究人员通过单细胞RNA测序技术（scRNA-seq），在单细胞分辨率下分析了PVT1-MYC融合转录本与经典MYC转录本的功能差异。

结果显示，在表达PVT1-MYC融合的细胞中，MYC下游靶基因的激活程度显著高于仅表达经典MYC的细胞。这种增强效应不仅体现在体外培养的细胞中，在小鼠异种移植模型（xenograft）中也同样存在。基因本体论（GO）分析表明，高水平的PVT1-MYC与蛋白质合成途径的过度激活密切相关，而这正是肿瘤快速增殖的物质基础。

为了证明这种融合基因对癌细胞生存的重要性，研究人员设计了一个“救援”实验。他们利用一种特制的细胞系，可以通过药物处理特异性地清除内源性的MYC。通常情况下，失去MYC会导致这些癌细胞迅速死亡。然而，当研究人员外源性地转入PVT1-MYC融合基因时，细胞的存活率显著高于转入经典MYC的对照组。

更令人深思的是，如果破坏了PVT1第1外显子中SRSF1的结合位点，这种救援能力就会大打折扣。这说明，PVT1-MYC融合基因之所以能成为更强的致癌驱动力，核心就在于其通过SRSF1获得的超强稳定性。

这项研究还揭示了ecDNA作为一种进化平台的独特优势。ecDNA是环状的，缺乏着丝粒，在细胞分裂时随机分配。这种特性使得肿瘤细胞群体中迅速产生极高的遗传异质性。在这个过程中，ecDNA不断发生断裂和重连，像是在进行一场高通量的“试错”实验。

PVT1位点由于其特殊的基因组特征（如脆性位点），本身就容易发生断裂。在ecDNA这个加速进化的反应堆中，PVT1第1外显子被保留下来，并与各种癌基因（如MYC）融合。由于这种融合带来了显著的生存优势（更稳定的癌基因mRNA，更强的下游信号），携带这种ecDNA的细胞在肿瘤微环境中脱颖而出，最终占据主导地位。

这项发表于《Cell》的研究，为我们描绘了一幅令人不安却又清晰的癌症进化图景。ecDNA不再仅仅是染色体外的游魂，它是肿瘤精心构建的“武器研发中心”。

01 平台效应

ecDNA是癌基因融合发生的主要场所，其产生的融合事件远超线性染色体扩增。

02 通用插件

PVT1第1外显子就像一个通用的“稳定器插件”，通过ecDNA上的重排，连接到不同的癌基因上。

03 机制破解

这种融合通过招募剪接因子SRSF1，逃避了细胞原本严密的mRNA降解机制（翻译偶联衰减），实现了癌基因信号的持续放大。

04 功能后果

由此产生的融合蛋白驱动了更强的肿瘤增殖信号，并在自然选择中赋予癌细胞巨大的生存优势。

这一发现对临床诊疗具有深远的意义。

首先，它解释了为什么某些携带基因扩增的患者预后更差。传统的检测方法往往只关注基因拷贝数，而忽略了ecDNA特有的结构变异和融合状态。如果能够结合拷贝数和PVT1融合检测，我们将能更精准地识别出那些极具侵袭性的ecDNA阳性肿瘤，检测准确率有望提升至95%。

其次，这些ecDNA特有的融合转录本（尤其是PVT1与各种伙伴的融合），在正常细胞中是不存在的。这为开发肿瘤特异性的疗法提供了绝佳的靶点。它们是天然的“新抗原”（Neoantigens），利用mRNA疫苗技术，我们或许可以训练免疫系统专门识别并攻击携带这些致命融合的癌细胞，而不会误伤无辜。

最后，针对SRSF1与PVT1第1外显子的相互作用，或许能开发出新型的小分子药物，打破这种致命的稳定性，让癌基因mRNA重新回到细胞正常的降解程序中，从而从根本上瓦解肿瘤的攻势。

癌症的进化虽然狡猾，但它依然遵循着生物物理和化学的法则。当我们看清了ecDNA制造混乱的机制，也就找到了让秩序回归的希望。这不仅是对癌症生物学的一次深刻洞察，更是未来精准医疗的一块重要拼图。

以下是该研究中几个值得玩味的细节，展示了高水平研究如何抽丝剥茧。

1. 数据的清洗与对照：排除“红鲱鱼”

在分析RNA融合数据时，研究团队并没有直接使用原始输出。他们实施了极其严格的过滤策略，排除了线粒体基因、HLA基因及免疫球蛋白基因等高变异区域的干扰。特别是，他们利用了“Red Herring”（红鲱鱼）注释，剔除了那些可能是测序假象的融合。正是这种严谨的数据预处理，才使得ecDNA上PVT1融合的高频现象（14.5%的ecDNA阳性样本携带融合）显得尤为可信。

2. 模型的数学之美：RNA衰减方程

在测定RNA稳定性时，研究人员没有仅依赖简单的半衰期描述，而是建立了常微分方程模型：

dT/dt = α - βT

其中 T是转录本总量，α是合成速率，β是衰减速率。在稳态时（dT/dt = 0），T0= α / β。通过使用放线菌素D阻断转录（α=0），转录本随时间的减少遵循指数衰减 T(t) = T0· e-βt。通过这种定量建模，他们精确计算出了β值，从而在数学上证明了PVT1-MYC融合转录本的衰减速率显著低于经典MYC。

3. 结构生物学的验证：DeepCLIP与AlphaFold3的结合

在验证SRSF1结合位点时，研究人员不仅依赖传统的生化实验（RNA-IP），还引入了深度学习模型DeepCLIP。这个模型是在ENCODE数据库的eCLIP数据上训练的，它能预测突变对蛋白-RNA结合的影响。DeepCLIP的评分显示，将“GAGGA”突变为“UUUAA”会显著降低SRSF1的结合概率。随后，AlphaFold3的结构预测进一步在原子层面展示了SRSF1的RRM结构域是如何“卡”在PVT1第1外显子上的。这种计算生物学与湿实验的完美互证，是值得借鉴的典范。

4. 技术的极限：单分子测序的威力

为了搞清楚复杂的ecDNA结构，研究人员使用了Nanopore长读长测序。传统的二代测序（短读长）在处理复杂的结构变异和重复序列时往往力不从心，就像试图用细碎的马赛克拼凑一幅巨大的画作。而长读长测序能够直接跨越断点，让研究人员看到了PVT1第1外显子是如何精确地与MYC的外显子2拼接在一起的。数据显示，这种拼接在COLO320DM细胞中占据了主导地位，PVT1-MYC融合构成了总MYC转录本的82%，而经典MYC仅占一小部分。

参考文献

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)01422-9

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